超全的分子技術——dpcr技術原理解析

一、PCR擴增

在進行PCR擴增前，需要將樣品稀釋至單分子水平，并平均分配到微小反應單元（幾萬個反應腔室）進行反應，可以使用微滴數字PCR芯片、微流控芯片或數字PCR芯片等分割技術。每個反應單元包含零個或一個目標分子。

由于對原樣品的大幅度的稀釋，使得PCR抑制劑濃度顯著降低，這樣dPCR對初始PCR反應物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。

二、熒光定量分析

與qPCR的對每個循環進行實時熒光測定方法不同，dPCR 技術是在擴增結束后，采集每個反應單元的熒光信號。

通常使用熒光探針、探針水解或熒光染料等方法對PCR產物進行檢測。根據產物是否達到熒光檢測閾值，可以判定每個反應單元是陽性還是陰性。

根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例，計算出目標基因的起始拷貝數或濃度。

DNA 模板分子的絕對濃度采用泊松分布概率公式計算：

當 k = 0 時，即反應單元中沒有模板DNA（空白背景）的情況，上式可簡化為：

當 k = 0 時，其概率 p(x = 0) 相當于空白背景的反應單元數與總的反應單元的比值：

為了得到模板分子的平均拷貝數 λ，將上式兩邊同時取對數，得到：

采用dPCR 技術進行核酸定量分析時，如果已知反應單元總數、稀釋倍數以及陽性反應單元數的情況下，即算出樣品中 DNA 模板分子的起始拷貝數。

dPCR技術優勢

高精確性：待測物原始濃度的定量既不依賴于校準物的標準曲線，也不受擴增效率的影響，避免了由于樣品與校準物擴增效率的不同而導致的結果不確定性與不準確性。

適合基質復雜樣品的檢測：如動物血樣、生物制品和藥物DNA殘留檢測等。