熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒——MB Venor Gem qEP的使用方法

測(cè)應(yīng)包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、樣品，并設(shè)置復(fù)管。所有試劑和樣品在使用前在2～8℃達(dá)到平衡。干粉溶解后，試劑應(yīng)在＜-18℃保存。避免反復(fù)凍融。溶解后的內(nèi)控對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)分裝保存。

從制備反應(yīng)體系開(kāi)始至去PCR擴(kuò)增步驟，所有操作應(yīng)在45分鐘內(nèi)完成，避免熒光信號(hào)衰減。遵循下表建立反應(yīng)體系。

1、根據(jù)樣本數(shù)來(lái)準(zhǔn)備預(yù)混液的體積。在室溫將下列組分在 1.5ml 反應(yīng)管中混合。

①符合藥典要求的檢測(cè)

②一般細(xì)胞培養(yǎng)物篩查

2、預(yù)混液用移液器吹打混勻（5 次）

3、每個(gè) PCR 管加入 15μl（對(duì)于符合歐洲藥典的檢測(cè)）或 23μl（對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)物的篩查）預(yù)混液，棄掉剩余液體。

三、添加樣品

在每個(gè)PCR中建立陰性(無(wú)模板控制，ntc)和陽(yáng)性控制。

四、進(jìn)行PCR擴(kuò)增

不同儀器，程序設(shè)置可能不同，詳情可留言咨詢。

FAM 通道檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。依據(jù) DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線和 Ct 值定量。具體步驟需參考具體 qPCR 儀及軟件的功能。我們推薦對(duì)包括對(duì)照在內(nèi)的每個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線進(jìn)行評(píng)估。

Ct＜40 為陽(yáng)性結(jié)果。Ct≥40 為陰性結(jié)果。支原體 DNA 和內(nèi)控 DNA 存在信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。支原體 DNA 越多，F(xiàn)AM 通道信號(hào)越高，檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的 HEX 通道信號(hào)越低。

檢測(cè)參數(shù)

檢測(cè)閾限采用歐洲藥典（EP2.6.7）規(guī)定的支原體物種作為模板測(cè)定。支原體來(lái)自培養(yǎng)基肉湯，并經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行了滴定。具體培養(yǎng)基種類，可留言咨詢。

特異性

熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒也可檢測(cè)更多的柔膜體物種（具體種類可留言咨詢），但不會(huì)檢測(cè)進(jìn)化樹(shù)上相關(guān)的其他物種，如梭菌、乳桿菌和鏈球菌。水生的伯克氏菌屬也不會(huì)被檢測(cè)到。和其他細(xì)菌和哺乳動(dòng)物 DNA 均無(wú)交叉反應(yīng)。

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