研究發現新的AAV CRISPR篩選方法，促進致病基因的研究

蘇黎世聯邦理工學院（ETH Zurich）領導的研究團隊利用腺相關病毒（AAV）開發出一種用于體內CRISPR篩選的新平臺，有助于更好地了解致病基因及其在各種細胞中的表型。

研究人員于9月20日在《Nature》雜志上發表了這一新成果。他們將這種名為AAV-Perturb-seq的技術應用在小鼠模型中，以了解DiGeorge綜合征相關基因的表型。

DiGeorge綜合征又被稱為22q11.2微缺失綜合征，由22號染色體上一個小片段的缺失引起。發病率大約為1/4000，通常會導致心臟問題、免疫缺陷和認知問題等癥狀。

研究人員指出，目前的CRISPR篩選方法主要使用慢病毒，**于體外應用，而且只適用于這種病毒可以感染的組織。他們認為，迫切需要適用于不同組織的體內單細胞篩選，這也是他們選擇AAV的原因，因為AAV可以靜脈注射，靶向更大范圍的組織和細胞類型。

“AAV-Perturb-seq讓人們有機會直接分析同一動物體內多個細胞類型中的多個基因，而不受組織或發育時間點的限制，為研究體內的健康和病變過程提供了更多可能，”作者寫道。

研究人員首先創建了一個AAV向導RNA（gRNA）文庫，其重點是位于人類22q11.2基因座內并在小鼠基因組中高度保守的基因。他們鑒定出29個在成年小鼠皮層中表達的基因，并為其設計了gRNA序列。

接下來，他們將含有gRNA的重組AAV注射到LSL-Cas9小鼠中，并在三周后采集大腦樣本。他們從各個細胞分離出細胞核后開展聚類分析，結果顯示AAV感染了小鼠的神經元和非神經元腦細胞。

他們的分析結果表明，對于22q11.2缺失小鼠模型，DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L基因的擾動解釋了大約40%的轉錄變化。然而，這些基因無法解釋DiGeorge綜合征患者為何容易患上神經發育和精神疾病。

盡管人們對每個基因在成熟腦細胞中的功能知之甚少，也從未開展過系統研究，但研究人員發現，DGCR14和GNB1L與成人神經元病理學之間存在關聯。

“總的來說，我們的結果表明，DGCR8、DGCR14和GNB1L可能對22q11.2微缺失綜合征有影響，它們通過調控成熟神經元的RNA廣泛改變體內與疾病易感性相關基因的表達，”作者總結道。

作者表示，下一步他們將確定在發育期間或之后恢復DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L的表達是否能挽救與22q11.2微缺失綜合征相關的神經元和認知表型。

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