RNA病毒檢測(cè)（RT-qPCR法）試劑的操作步驟

　　RNA病毒檢測(cè)試劑盒（RT-qPCR法）（英文名：ConviFlex?RT-Taq mix）用于定性檢測(cè)和分析RNA病毒和RNA分子，特別適合檢測(cè)新冠病毒等此類(lèi)病毒。本文締一生物為您介紹。

　　步驟1. 凍干粉ConviFlex?RT-Taq Mix，**速離心5秒鐘，然后加入260μl復(fù)溶緩沖液2×Rehydration Buffer，室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

　　步驟2.   每個(gè)反應(yīng)體系為20μl，其中反應(yīng)mix為15μl。

　　（1）依據(jù)本次試驗(yàn)樣本數(shù)，制備RT-qPCR的反應(yīng)mix。

　　1個(gè)反應(yīng)mix需要：

　　①ConviFlex? RT-Taq Mix（即上面復(fù)溶的預(yù)混液）10μl，

　　②引物（濃度0.1 - 0.5 μM）

　　③探針（濃度0.1 - 0.5 μM）

　　④PCR級(jí)水（使每管總體積為15μl）

　　注：引物和探針的推薦濃度范圍是0.1-0.5 μM。

　　通常，引物濃度過(guò)高，會(huì)增加引物錯(cuò)配和非特異RT-PCR產(chǎn)物。然而，當(dāng)RT-PCR程序運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)或使用簡(jiǎn)并引物時(shí)，則推薦引物濃度升高至1 μM。（注意：若使用簡(jiǎn)并引物，同一RT-PCR分析中，引物之間應(yīng)具有相同的熔解溫度）

　　（2）將反應(yīng)mix渦旋并離心5秒鐘。

　　（3）每個(gè)PCR管中加入15μl反應(yīng)mix和5μl樣本（抽提后的RNA），

　　或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對(duì)照，或5μl PCR級(jí)水作為無(wú)模板對(duì)照，或5μl陽(yáng)性對(duì)照。

　　（4）扣緊PCR管，然后短暫離心。

　　（5）將PCR管放置qPCR儀上，蓋好蓋。

　　步驟3. 在qPCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序，

　　示例:   1 cycle   50 °C for 20 min

　　1 cycle   95 °C for 10 min

　　45 cycles 95 °C for 15 sec

　　60 °C for 1 min

　　(以上程序僅依據(jù)廠(chǎng)家經(jīng)驗(yàn)，用戶(hù)可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溫度和孵育時(shí)間)

　　步驟4. 啟動(dòng)程序

　　綜上所述，您是不是已經(jīng)對(duì)RNA病毒檢測(cè)（RT-qPCR法）試劑的操作步驟，有所了解。如果還有其他疑問(wèn)，請(qǐng)咨詢(xún)威正翔禹/締一生物資深專(zhuān)家。

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