PCR法在雞毒支原體污染檢測(cè)方法

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）是一種常見(jiàn)的雞呼吸道病原體，可引起雞的慢性呼吸道疾病，嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能和健康狀況。因此，對(duì)雞毒支原體污染進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)至關(guān)重要。本文將介紹使用PCR法進(jìn)行雞毒支原體污染檢測(cè)的方法。

PCR法是一種基于DNA體外擴(kuò)增的技術(shù)，通過(guò)特定的引物和DNA聚合酶，將特定的DNA片段在體外進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。PCR法具有高特異性、高靈敏度和快速等優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測(cè)樣品中微量的DNA片段。

PCR法檢測(cè)雞毒支原體污染

樣品采集：采集雞的呼吸道分泌物、雞胚尿囊液和雞場(chǎng)環(huán)境樣本等，用于檢測(cè)雞毒支原體污染。

DNA提取：將采集的樣品進(jìn)行處理，提取其中的DNA片段。可使用德國(guó)MB DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)雞毒支原體基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增特定的DNA片段。通常擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段為100-300bp。

試劑制備：

PCR體系建立：

啟動(dòng)PCR反應(yīng)：

電泳結(jié)果分析：

191bp為內(nèi)控對(duì)照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。

當(dāng)樣本存在支原體污染時(shí)，由于內(nèi)控對(duì)照與支原體DNA存在競(jìng)爭(zhēng)，內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)酰ɡ缰гwDNA＞10^3拷貝）。

陽(yáng)性對(duì)照中支原體DNA＞10^4拷貝，內(nèi)控對(duì)照條帶會(huì)完全消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測(cè)結(jié)果。

如果待測(cè)樣本對(duì)PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)酰ê完幮詫?duì)照相比），此時(shí)應(yīng)先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor? Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒），然后再檢測(cè)。

德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒，依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別，分一步法和經(jīng)典法兩類。此兩類試劑盒較全球其他廠家同類產(chǎn)品，具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：

①符合歐洲藥典要求。

②高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測(cè)到107種支原體物種。操作簡(jiǎn)單，易于觀察（使用MB的試劑盒，下表中列出的支原體物種均為陽(yáng)性，其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)）。

③高靈敏度，1-5拷貝/μl的支原體DNA即可檢出。

④試劑盒含內(nèi)控對(duì)照，可防止假陰性的發(fā)生。