microRNA表達的活細胞成像與轉錄后反饋控制

　　microrna (mirna)是真核細胞中調控復雜基因表達網絡的小型非編碼rna。由于其獨特的表達模式，mirna是特定細胞狀態的潛在分子標記物。雖然需要一個能夠在活細胞中成像miRNA的系統來直觀地檢測miRNA的表達，但很少有響應靶miRNA表達的熒光信號傳感器(miron傳感器)可用。

　　在這里，作者報道了一個包含雙向啟動子驅動的Csy4核糖核酸內切酶和綠色熒光蛋白ZsGreen1的miron傳感器，用于轉錄后反饋控制的miRNAs活細胞成像。Csy4 輔助的 miR-ON (Csy4-miR-ON) 傳感器產生的背景可以忽略不計，但對目標 miRNA 反應靈敏，允許在各種人類細胞中對 miRNA 進行高對比度熒光檢測。作者發現，Csy4-miRON傳感器能夠在體外和體內對各種mirna進行成像，包括miR-21、miR-302a和miR-133。這個強大的工具可以用來評估miRNA表達在不同的生物和醫學應用。

　　microrna (mirna)是一類調節基因表達的非編碼小rna。不同類型的細胞表現出獨特的miRNA表達模式，在分化、腫瘤發生和病毒感染等物理和病理過程中動態變化。miRNA表達異常與廣泛的人類疾病的發病和進展密切相關; 因此，mirna是潛在的治療和診斷靶點。針對參與腫瘤進展或抑制的 miRNA 的策略已被廣泛探索用于癌癥治療。此外，一些mirna在特定的細胞類型中高度表達，在許多情況下，直接參與決定細胞命運。因此，這些mirna可以作為明確的分子標記，從異質細胞群中分離出特定的細胞。

　　miRNA表達的研究可以揭示miRNA的功能，并用于評估細胞狀態。Northern blot、微陣列、定量逆轉錄酶PCR和最近的RNA測序已被廣泛用作分析mirna表達的標準技術。然而，這些方法與細胞裂解相關，因此不適合檢測活細胞中miRNA表達的動態變化。此外，由此產生的大量miRNA群體不太可能適合單細胞分析。相比之下，基于熒光或生物發光成像的無創技術在實時分析miRNA表達方面非常有利。

　　此前，作者和其他人已經報道了含有熒光報告基因的miRNA傳感器系統，該基因含有多個互補序列，針對其3 '非翻譯區(UTR)感興趣的miRNA。在這些系統中，靶miRNA與其互補序列的結合會導致報告基因編碼mrna的降解，導致報告基因活性降低。這種類型的miRNA傳感器(miroff傳感器)通過監測熒光強度下降的程度，可以實時、長期跟蹤活細胞中miRNA的表達。miroff傳感器已經成功地用于分析培養細胞和動物中的mirna。

　　盡管 miR-OFF 傳感器具有顯著的效力，但由于 miRNA 活性檢測的模式，很難區分由 miRNA 表達以外的原因引起的假陽性； 即熒光消失。重要的是，驅動報告基因表達的啟動子活性取決于細胞類型、基因組背景和表觀遺傳控制; 在某些情況下，如長期細胞培養或細胞分化，啟動子活性降低或喪失是可能的。為了降低誤報的風險，需要一種miRNA表達時產生熒光的miRNA傳感器(miron傳感器)。特別是，基因編碼的基于熒光的miron傳感器在培養細胞和動物中miRNA表達的活細胞成像方面具有優勢。此外，這些miron傳感器可能適用于長期的miRNA檢測。

　　因此，miron傳感器應該能夠對腫瘤發生等發病過程中的miRNA表達進行可靠的評估，使其成為非侵襲性診斷的潛在工具。此外，這些傳感器可用于分離體外分化和細胞重編程后表達組織特異性mirna的細胞，為細胞治療和再生醫學制備細胞來源。然而，一些固有的困難，包括準確的開關和適當的信噪比增益，是設計一個有效的miRON系統能夠敏感地檢測miRNA表達的挑戰。

　　在本研究中，作者報道了一個基于miRNA-responsive Csy4轉錄后反饋控制的miron系統。Csy4是一種核糖核酸內切酶，負責處理來自銅綠假單胞菌中聚集的規律性間隔短回語重復序列(CRISPRs)的前體轉錄本。CRISPR系統通過使用與外源核酸互補的CRISPR相關(Cas)蛋白和CRISPR RNA復合物，在消除原核生物中的入侵寄生蟲方面發揮著核心作用。

　　Csy4 特異性識別保守莖環的 28 nt 序列，然后切割莖堿基的 3' 末端。Csy4已被廣泛應用于rna -蛋白結合分析、可編程基因網絡設計、基因組編輯等生物學領域。作者設計了一個Csy4輔助miron (Csy4- miron)傳感器，包含Csy4基因和一個由雙向啟動子驅動的熒光報告蛋白ZsGreen1 (ZsG)。

　　csy4 - miron傳感器可用于在體內和體外成像miRNA表達。重要的是，這種傳感器產生了固有的低背景，允許高對比度的熒光成像。作者提供了一個寶貴的工具miRNA分析和評估細胞狀態在不同的生物學和醫學研究。