服務(wù)熱線 400-166-8600

支原體PCR檢測試劑盒一步法Venor?GeM OneStep使用詳解

Venor?GeM OneStep支原體PCR檢測試劑盒使用詳解

二維碼

發(fā)表時(shí)間：2023-12-07 13:52

Venor?GeM OneStep是一種通過常規(guī)PCR直接檢測細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞培養(yǎng)基和其他生物基質(zhì)中支原體污染的試劑盒。該產(chǎn)品來自德國MB，締一生物國內(nèi)總代理此產(chǎn)品。該試劑盒旨在要求最少的移液，包括PCR所需的所有試劑:引物，核苷酸，聚合酶和內(nèi)部擴(kuò)增控制，提供即用型凍干反應(yīng)混合物。用所含緩沖液復(fù)溶后，根據(jù)樣品數(shù)量將混合物分配到反應(yīng)管中。在PCR前只需要加入樣品或?qū)φ铡?/span>

Venor?GeM OneStep 常規(guī)支原體PCR檢測試劑盒一步法產(chǎn)品特點(diǎn)

Venor?GeM OneStep試劑盒基于傳統(tǒng)(或終點(diǎn))PCR，作為快速、穩(wěn)健、敏感檢測支原體污染的既定方法。

檢測特異性強(qiáng)

試劑盒中包含的引物集專門針對并擴(kuò)增支原體基因組高度保守的16S rRNA編碼區(qū)。這允許檢測通常在細(xì)胞培養(yǎng)中作為污染物遇到的多種支原體。根據(jù)支原體種類的不同，擴(kuò)增子的大小在265-278 bp之間。真核生物(包括人類)和其他細(xì)菌DNA(“檢測特性”部分報(bào)道的DNA除外)不能通過Venor?GeM OneStep試劑盒擴(kuò)增。

檢測時(shí)間短

整個(gè)測試需要不到3小時(shí)，并且與基于發(fā)光的酶測定、熒光染色或培養(yǎng)方法相比，不需要活的支原體細(xì)胞。3

操作簡便、配套產(chǎn)品齊全

試劑盒包含常規(guī)PCR所需的所有成分。凍干的OneStep Mix包括熱啟動Taq聚合酶、引物和dntp。該混合物還包含一個(gè)內(nèi)部控制DNA，以驗(yàn)證PCR反應(yīng)是否在沒有任何抑制的情況下發(fā)生。所提供的凍干陽性對照DNA可用于檢查檢測試驗(yàn)的全部功能。內(nèi)部對照DNA和陽性對照DNA是評估分析性能的基本工具。

一旦溶解在給定的緩沖液中，OneStep Mix只需要在加入樣品之前將其放入反應(yīng)管中，然后進(jìn)行PCR。OneStep Mix含有dUTP而不是dTTP，以促進(jìn)使用尿嘧啶- DNA糖基酶(UNG)降解擴(kuò)增子攜帶。

Venor?GeM OneStep 常規(guī)支原體PCR檢測試劑盒一步法使用方法詳解

當(dāng)細(xì)胞長至整個(gè)培養(yǎng)器皿的80% - 90%時(shí)，應(yīng)采集樣品。細(xì)胞培養(yǎng)上清液非常適合支原體試驗(yàn)，不需要額外的樣品制備。然而，PCR抑制物質(zhì)可能在細(xì)胞培養(yǎng)基中積累，這就需要在PCR測試之前提取DNA。

細(xì)胞培養(yǎng)中支原體的平均滴度為每毫升約10^6個(gè)細(xì)胞，不超過每毫升10^8個(gè)細(xì)胞。

01制備樣品模板

①將100μl至500μl細(xì)胞培養(yǎng)上清從試驗(yàn)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.5 ml反應(yīng)管中。注意:確保蓋子蓋緊或密封。

②將樣品上清液在95℃下孵育10分鐘(至少5分鐘)。

③將樣本的上清液將離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)至MAX，離心5秒。

④直接使用2μl用于PCR，或在+2°C至+8°C可儲存6天，或≤-18°C條件下長期保存樣品。

注意：細(xì)胞碎片不能作為樣品直接檢測，會干擾PCR反應(yīng)。但細(xì)胞碎片，還有胎牛血清，疫苗（病毒），及石蠟包被的樣品，經(jīng)DNA抽提后可以用來檢測。推薦抽提試劑盒：Minerva Biolabs: MB DNA Extraction Kit(No. 56-1100）

02重懸試劑

03加樣

04PCR循環(huán)

按照官方指導(dǎo)的使用說明上進(jìn)行程序設(shè)計(jì)，詳情點(diǎn)擊“閱讀原文”獲取。

05電泳及結(jié)果分析

1.5%標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖膠，厚度約5mm，5 mm梳子。每孔需加樣5 μl，與溴酚藍(lán)和電泳緩沖液混合。當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)遷移到2cm遠(yuǎn)的位置時(shí)，停止電泳（根據(jù)使用電泳儀的情況，確定是否中止電泳。如：電壓100V，電泳20分鐘）。

每條泳道均在191 bp的位置出現(xiàn)一條明顯的條帶，是內(nèi)控對照，則表明PCR反應(yīng)成功。當(dāng)支原體DNA>5x106 copies/ml 時(shí)，這條帶隨著支原體DNA含量的增加而減褪。陽性對照的支原體起始濃度A>5x10^6 copies/ml, 陽性對照的內(nèi)控條帶通常不是很明顯。