支原體PCR檢測試劑盒一步法Venor?GeM OneStep使用詳解Venor?GeM OneStep支原體PCR檢測試劑盒使用詳解 二維碼
發表時間：2023-12-07 13:52 Venor?GeM OneStep是一種通過常規PCR直接檢測細胞培養物、細胞培養基和其他生物基質中支原體污染的試劑盒。該產品來自德國MB，締一生物國內總代理此產品。該試劑盒旨在要求最少的移液，包括PCR所需的所有試劑:引物，核苷酸，聚合酶和內部擴增控制，提供即用型凍干反應混合物。用所含緩沖液復溶后，根據樣品數量將混合物分配到反應管中。在PCR前只需要加入樣品或對照。
Venor?GeM OneStep試劑盒基于傳統(或終點)PCR，作為快速、穩健、敏感檢測支原體污染的既定方法。
檢測特異性強 試劑盒中包含的引物集專門針對并擴增支原體基因組高度保守的16S rRNA編碼區。這允許檢測通常在細胞培養中作為污染物遇到的多種支原體。根據支原體種類的不同，擴增子的大小在265-278 bp之間。真核生物(包括人類)和其他細菌DNA(“檢測特性”部分報道的DNA除外)不能通過Venor?GeM OneStep試劑盒擴增。 檢測時間短 整個測試需要不到3小時，并且與基于發光的酶測定、熒光染色或培養方法相比，不需要活的支原體細胞。3 操作簡便、配套產品齊全 試劑盒包含常規PCR所需的所有成分。凍干的OneStep Mix包括熱啟動Taq聚合酶、引物和dntp。該混合物還包含一個內部控制DNA，以驗證PCR反應是否在沒有任何抑制的情況下發生。所提供的凍干陽性對照DNA可用于檢查檢測試驗的全部功能。內部對照DNA和陽性對照DNA是評估分析性能的基本工具。 一旦溶解在給定的緩沖液中，OneStep Mix只需要在加入樣品之前將其放入反應管中，然后進行PCR。OneStep Mix含有dUTP而不是dTTP，以促進使用尿嘧啶- DNA糖基酶(UNG)降解擴增子攜帶。 Venor?GeM OneStep 常規支原體PCR檢測試劑盒一步法使用方法詳解
當細胞長至整個培養器皿的80% - 90%時，應采集樣品。細胞培養上清液非常適合支原體試驗，不需要額外的樣品制備。然而，PCR抑制物質可能在細胞培養基中積累，這就需要在PCR測試之前提取DNA。 細胞培養中支原體的平均滴度為每毫升約10^6個細胞，不超過每毫升10^8個細胞。 01制備樣品模板 ①將100μl至500μl細胞培養上清從試驗培養物轉移到1.5 ml反應管中。注意:確保蓋子蓋緊或密封。 ②將樣品上清液在95℃下孵育10分鐘(至少5分鐘)。 ③將樣本的上清液將離心機轉速調至MAX，離心5秒。 ④直接使用2μl用于PCR，或在+2°C至+8°C可儲存6天，或≤-18°C條件下長期保存樣品。 注意：細胞碎片不能作為樣品直接檢測，會干擾PCR反應。但細胞碎片，還有胎牛血清，疫苗（病毒），及石蠟包被的樣品，經DNA抽提后可以用來檢測。推薦抽提試劑盒：Minerva Biolabs: MB DNA Extraction Kit(No. 56-1100） 02重懸試劑
03加樣
04PCR循環 按照官方指導的使用說明上進行程序設計，詳情點擊“閱讀原文”獲取。 05電泳及結果分析 1.5%標準瓊脂糖膠，厚度約5mm，5 mm梳子。每孔需加樣5 μl，與溴酚藍和電泳緩沖液混合。當指示劑溴酚藍遷移到2cm遠的位置時，停止電泳（根據使用電泳儀的情況，確定是否中止電泳。如：電壓100V，電泳20分鐘）。 每條泳道均在191 bp的位置出現一條明顯的條帶，是內控對照，則表明PCR反應成功。當支原體DNA>5x106 copies/ml 時，這條帶隨著支原體DNA含量的增加而減褪。陽性對照的支原體起始濃度A>5x10^6 copies/ml, 陽性對照的內控條帶通常不是很明顯。
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