蛋白質(zhì)組學再立戰(zhàn)功：揭示了BCAT1在癌細胞轉(zhuǎn)移中的重要作用

　　癌癥是對人類健康威脅**的疾病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計，2018 年全球新發(fā)癌癥病例達到 1,807 萬例，其中肺癌 209 萬例，發(fā)病率名列前茅。

　　中國癌癥新發(fā)患者人數(shù)也在逐年增加，根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的全國最新癌癥數(shù)據(jù)，2015 年全國新發(fā)惡性腫瘤病例數(shù)約 392.9 萬例，肺癌位居發(fā)病首位。

　　肺癌患病率逐年攀升，轉(zhuǎn)移是肺癌高死亡率的主要原因之一，嚴重危害人類公共健康。

　　肺癌是如何轉(zhuǎn)移的？

　　哪些因素會影響肺癌轉(zhuǎn)移？

　　如何斷了癌細胞后路，避免其轉(zhuǎn)移？

　　這些問題一直困擾著研究人員。

　　近日，《Theranostics》上發(fā)表了一篇標題為：“Proteomic analysis of lung cancer cells reveals a critical role of BCAT1 in cancer cell metastasis”的論文，或許可以在一定程度上回答上述問題。

　　圖片來源：https://www.thno.org/v11p9705.htm

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　　濃縮精華版：

　　研究人員發(fā)現(xiàn)：在轉(zhuǎn)移性肺癌細胞和肺癌患者的轉(zhuǎn)移性組織中，分支鏈氨基酸代謝的關鍵酶BCAT1蛋白水平呈現(xiàn)過表達狀態(tài)。通過數(shù)據(jù)分析分析得出結論：BCAT1轉(zhuǎn)錄的增加，與肺癌患者總生存率較低之間存在關聯(lián)性。

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　　在過去的十年中，基因組測序越來越多地被應用到轉(zhuǎn)移性腫瘤突變譜的研究中 [1，2]。已有一些研究，對肺癌患者標本進行了全面的蛋白質(zhì)基因組學研究，繪制了呈現(xiàn)了原發(fā)腫瘤相對于腫瘤旁“正常”組織的蛋白質(zhì)組圖 [3，4]。然而，關于轉(zhuǎn)移性肺癌的蛋白質(zhì)組水平的相關研究仍然不足。

　　我們已經(jīng)知道，氨基酸代謝在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

氨基酸密碼子對照表

　　支鏈氨基酸(BCAA)到α-酮戊二酸(α-KG)的轉(zhuǎn)氨基反應，由胞質(zhì)BCAT1和線粒體BCAT2兩種類型的bcat基因催化。該反應產(chǎn)生谷氨酸，而谷氨酸又可以被腫瘤細胞優(yōu)先利用以促進生存[5]。

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　　由此得到的支鏈酮酸(BCKA)進一步分解為乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，它們是TCA循環(huán)的中間體[6]。BCAT1的過表達與髓樣白血病[7]、膠質(zhì)瘤[8]和非小細胞肺癌[9]的癌癥進展有關，而增加BCAA攝取對于維持NSCLC[10]的腫瘤發(fā)生很重要。然而，BCAT1的表達過程，是否在轉(zhuǎn)移性腫瘤中出現(xiàn)紊亂？在潛在的遷移過程中發(fā)揮作用？這些目前尚不清楚。

　　為了確定與肺癌轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關的蛋白質(zhì)組學的變化，研究人員用到了一種同位素標記(SILAC：細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記，在細胞培養(yǎng)過條件下，用含有輕、重同位素標記氨基酸的培養(yǎng)基，進行細胞培養(yǎng)，若干代后，細胞中的蛋白質(zhì)被穩(wěn)定標記上同位素)的定量質(zhì)譜分析。

　　利用原發(fā)性肺腺癌A549細胞系(指定L0)和L0細胞進行了三輪BALB/c Nude小鼠體內(nèi)選擇，產(chǎn)生脊柱轉(zhuǎn)移細胞(指定L2和L6)[11]。然后，分別在“輕、中、重”三種同位素標記的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，穩(wěn)定標記后進行質(zhì)譜定量分析。

　　得到結果1

　　轉(zhuǎn)移細胞顯示出與原代細胞不同的蛋白質(zhì)表達譜。相對于L0細胞，L6細胞中有74個蛋白、L2中有86個蛋白發(fā)生了顯著變化。

　　在顯著改變的蛋白質(zhì)中，33個在兩種轉(zhuǎn)移細胞系(L2和L6)中出現(xiàn)重疊。

　　最顯著富集的通路是氨基酸代謝過程（1C-D）BCAT1, BCAA代謝速率限制酶，是轉(zhuǎn)移細胞中最一致的上調(diào)蛋白。并且，上調(diào)蛋白的mRNA水平也升高。

　　隨后，作者又比較分析了四對，來自腫瘤患者樣本的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤組織進行蛋白質(zhì)組學。

　　采用串聯(lián)質(zhì)譜(TMT)標記和質(zhì)譜定量分析方法檢測蛋白表達，利用TCGA數(shù)據(jù)進行分析。

　　得到結果2

　　鑒定出14個變化顯著的蛋白。其中大部分改變的蛋白參與免疫反應通路，包括干擾素- γ和PPAR信號通路。這些改變的蛋白也存在于先前SILAC質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)庫中。

　　患者的總生存期(OS, n = 241)與BCAT1表達呈負相關 ，表明，BCAT1可能是肺癌進展的一個弱預后標志物。

　　接著，研究人員利用A549細胞系，進行了一系列細胞學實驗以及分子實驗：Western blot、trans-well、RNA干擾等，以及小鼠體內(nèi)實驗，進一步探究BCAT1在轉(zhuǎn)移中的作用。

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　　得到結果3

　　與使用原代和轉(zhuǎn)移性A549細胞株的SILAC蛋白質(zhì)組學結果一致，Western blot檢測BCAT1發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性細胞中顯著增加。

　　L2和L6細胞的遷移能力明顯高于原代L0細胞，說明轉(zhuǎn)移性更高。

　　穩(wěn)定表達shRNA對抗BCAT1 (shBCAT1)的L2和L6細胞，并進行了反轉(zhuǎn)錄實驗。表達shBCAT1的細胞的遷移速度明顯慢于表達重組shRNA的對照細胞。

　　體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)：與對照組細胞相比，接種表達shBCAT1的L6細胞的小鼠的癌細胞轉(zhuǎn)移率降低。

　　對主要轉(zhuǎn)移部位(股骨和脛骨)的Micro-CT分析顯示，接種轉(zhuǎn)移細胞的小鼠有嚴重的骨性侵蝕(與L6和L0細胞相比)，而接種表達shBCAT1的轉(zhuǎn)移細胞的小鼠骨性侵蝕小得多。

　　最終得出結論：敲除BCAT1后，體外轉(zhuǎn)移的L2和L6細胞遷移能力減弱，體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移的嚴重程度大大降低，幾乎達到L0水平。BCAT1的過表達可能驅(qū)動肺癌細胞轉(zhuǎn)移，而降低BCAT1的表達抑制了癌細胞的遷移和轉(zhuǎn)移。

　　為了深入了解BCAT1介導的轉(zhuǎn)移的機制，研究人員檢測了與干細胞和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關基因的表達。

　　得到結果4

　　在L2和L6細胞中，干細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2在mRNA和蛋白水平均顯著升高。

　　SOX2是維持胚胎干細胞和腫瘤干細胞可塑性的轉(zhuǎn)錄因子，它的過表達促進了肺癌的轉(zhuǎn)移。在已有研究中，SOX2的表達增加可能會使L0細胞進入低分化狀態(tài)，遷移能力增加。

　　文章作者從先前的研究[11]中重新分析了這些A549細胞的RNA-seq數(shù)據(jù)。

　　得到結果5

　　SOX2下游的許多基因在L2和L6細胞中均顯著上調(diào)，包括Wnt信號基因NOTCH3、DVL1、DVL2和致癌基因KLF4。

　　與SOX2相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，包括FOXK1和FOXC1，增加了表達。

　　最顯著富集的通路是氨基酸代謝過程（1C-D）BCAT1, BCAA代謝速率限制酶，是轉(zhuǎn)移細胞中最一致的上調(diào)蛋白。并且，上調(diào)蛋白的mRNA水平也升高。

　　然而，在先前的SILAC實驗結果中，轉(zhuǎn)移細胞中包括CTNNB1和DVL2在內(nèi)的Wnt信號蛋白減少。He等人之前的一項研究也表明，過表達SOX2可能通過上調(diào)A549細胞[12]中的GSK3β，導致Wnt/β-catenin信號通路的抑制。

　　因此，作者假設SOX2通過β-catenin抑制Wnt信號，維持轉(zhuǎn)移細胞的未分化狀態(tài)。

　　為了驗證這一假設，研究人員用幾種不同的方式：熒光成像、流式細胞術、Western blot、Real-time PCR，確定了BCAT1在轉(zhuǎn)移性A549細胞中促進了SOX2的表達，這一新的途徑可能是肺癌細胞干性的重要調(diào)控因子。

　　得到結果6

　　α-KG水平確實在L2和L6細胞中降低，而降低BCAT1的表達部分恢復了α-KG水平。

　　谷氨酸、KIV和BCAAs在轉(zhuǎn)移細胞中積累。

　　隨著降低BCAT1的表達，這些氨基酸和酮酸的水平也會降低。由于α-KG是DNA去甲基化酶TET2的輔助因子，降低α-KG濃度可能導致靶基因啟動子區(qū)域的高甲基化，從而沉默這些基因。

　　檢測了DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)L2和L6細胞中5-甲基脫氧胞嘧啶(5mdC)顯著升高，表明DNA有整體高甲基化的趨勢。

　　在表達sh-BCAT1的L2和L6細胞中，5mdC大量減少。此外，在L2和L6細胞中觀察到組蛋白甲基化增加的現(xiàn)象。

　　TET2調(diào)控的許多基因中有編碼micro-RNAs的基因，已有研究表明miR200家族成員是SOX2的負調(diào)控因子。

　　這提出了一種可能性：

　　即bcat介導的α-KG的減少導致miR200家族成員的高甲基化，并解除了SOX2的翻譯抑制。

　　分析顯示miR200c的表達與BCAT1呈負相關。

　　有報道稱：miR-200c表達的丟失在NSCLC中誘導了侵襲性表型。研究人員測量了miR200c，以及其他后續(xù)實驗。

　　得到結果7

　　miR200c在L2和L6細胞中觀察到統(tǒng)計學上顯著的大幅減少。

　　敲除BCAT1可增加miR200c的表達。

　　另外兩種可以靶向SOX2 mRNA的microRNA：miR429和miR21-5p，在BCAT1敲除后也表現(xiàn)出類似的效果，盡管它們在轉(zhuǎn)移細胞中表達水平不同。

　　添加DM-α-KG(一種能夠穿透細胞膜的α-KG類似物)，可以在L2和L6細胞中以劑量依賴性的方式降低SOX2的表達。

　　DM-α-KG治療也增加了轉(zhuǎn)移細胞中的miR200c。

　　因此，研究人員認為：

　　BCAT1-α-KG-miR200c-SOX2

　　調(diào)控途徑成立！

　　綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)BCAT1在轉(zhuǎn)移性肺癌細胞中表達上調(diào)，調(diào)控其遷移轉(zhuǎn)移，并與不良預后相關。該研究確定了一條新的通路，其中α-KG是轉(zhuǎn)移性肺癌細胞中BCAT1和SOX2表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控之間的關鍵代謝信號傳導中間體。

　　這些發(fā)現(xiàn)可能為靶向肺癌轉(zhuǎn)移過程的治療開辟新的策略。

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