新研究闡釋猴痘病毒DNA聚合酶F8-A22-E4-H5四元復(fù)合物的工作機制

自2022年5月疫情暴發(fā)以來，猴痘在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，威脅人類健康。今年6月份以來，我國猴痘病例驟增，國家衛(wèi)健委已將猴痘納入乙類傳染病管理。引發(fā)此次疫情的猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）屬于痘病毒科（Poxviridae family）正痘病毒屬（Orthopoxvirus genus），是一種大型、有包膜、雙鏈DNA病毒。該家族還有兩個熟知的成員，痘苗病毒（vaccinia virus）和天花病毒（variola virus）。DNA復(fù)制機器尤其是DNA聚合酶是抗正痘病毒藥物的重要靶標，該復(fù)合物高分辨率結(jié)構(gòu)的解析能夠為抗猴痘藥物和疫苗的開發(fā)提供關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

大部分DNA病毒在宿主細胞核內(nèi)進行基因組的復(fù)制，而包括猴痘病毒在內(nèi)的痘病毒的基因組復(fù)制在宿主胞質(zhì)中完成，其DNA復(fù)制所需的關(guān)鍵蛋白因子主要由病毒基因組編碼，包括DNA聚合酶F8（猴痘病毒和痘苗病毒同源蛋白命名有一定差異，本文出現(xiàn)的蛋白因子均按猴痘病毒系統(tǒng)命名）、DNA解旋酶/引物酶E5、尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil-DNA glycosidase，UDG）E4、與E4共同組成聚合酶復(fù)制持續(xù)性因子（processivityfactor）異源二聚體的A22以及多功能磷酸化蛋白H5等。F8是DNA聚合酶復(fù)合物的核心催化亞基，但只能合成小于10堿基的小片段產(chǎn)物，A22-E4二聚體與F8形成穩(wěn)定三元復(fù)合物，可以增強聚合酶復(fù)制的持續(xù)性，因此該三元復(fù)合物也被認為是痘病毒的DNA聚合酶全酶。此外，UDGE4可以識別并切除DNA中的尿嘧啶單堿基突變并啟動DNA修復(fù)途徑。UDG作為必需因子整合到聚合酶全酶中是痘病毒聚合酶所特有的，這種DNA合成和尿嘧啶堿基搜索/切除兩個過程耦合的機制尚不明確(Moss, 2013)。H5是一種多功能蛋白，也是痘病毒DNA復(fù)制的必需因子，但針對H5在DNA復(fù)制過程中的分子機制還完全不清楚(Boyle et al., 2015; McCraith et al., 2000)。

2023年12月7日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、PKU-THU生命科學(xué)聯(lián)合中心高寧教授課題組在Molecular Cell雜志最新一期發(fā)表題為“Structural insights into the assembly and mechanism of monkeypox virus DNA polymerase complex F8-A22-E4-H5”的研究論文，解析了猴痘病毒DNA聚合酶全酶四元復(fù)合物不同功能狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)，闡釋了這些病毒復(fù)制因子在DNA復(fù)制過程中的分子機制。

圍繞DNA聚合酶F8和UDGE4的功能，該工作通過在復(fù)合物中加入不同DNA底物的方式，捕捉到F8-A22-E4-H5四元復(fù)合物不同的構(gòu)象狀態(tài)，包括聚合酶在工作過程中為維持復(fù)制保真性需要不斷轉(zhuǎn)換的經(jīng)典的“open”和“closed”兩種構(gòu)象狀態(tài)，以及UDGE4結(jié)合特異性底物（包含dU堿基的DNA）的催化后構(gòu)象。作者對這些復(fù)合物樣品分別進行了冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，最高分辨率達到2.7 ?（圖2）。F8、A22和E4以1:1:1形式存在，而H5以四聚體形式結(jié)合在復(fù)合物中。A22含有四個結(jié)構(gòu)域，呈U型結(jié)構(gòu)分布。作為腳手架蛋白，A22同時介導(dǎo)了三個功能元件F8、E4和H5的整合，是聚合酶四元復(fù)合物組裝的核心元件。

UDGE4結(jié)合在單鏈模板DNA區(qū)域，位于聚合酶F8酶活中心上游（圖2C）。在添加有E4特異性DNA底物（-7位為尿嘧啶，dU-7）的四元復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，可以看到U堿基被切除（圖3A-B），形成一個無堿基的位點，表明聚合酶中的E4具有UDG酶活性，也再次從結(jié)構(gòu)證明了痘病毒中DNA尿嘧啶單堿基修復(fù)和DNA合成過程是耦合在一起的。不同狀態(tài)的結(jié)構(gòu)分析表明E4和F8的兩個活性中心之間具有7-10 nt的間隔（圖2C）。同其它UDG類似，以往的E4結(jié)構(gòu)和功能研究主要以dsDNA底物為研究對象。作者**獲得了E4結(jié)合有ssDNA的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)E4結(jié)合和作用于ssDNA的機制與dsDNA類似（圖3B-C）。

原核生物和真核生物經(jīng)典的DNA聚合酶中的復(fù)制持續(xù)性因子PCNA結(jié)合在聚合酶活性中心下游的dsDNA區(qū)域（圖4A），環(huán)繞dsDNA防止DNA底物的脫落。在猴痘病毒聚合酶四元復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，已知的復(fù)制持續(xù)因子A22-E4結(jié)合在活性中心上游的模板ssDNA區(qū)域（圖2C），在分子機制上與PCNA完全不同。該工作的結(jié)構(gòu)分析認為，A22-E4可能一方面通過E4與ssDNA的結(jié)合特性促進聚合酶與DNA底物的結(jié)合，另一方面A22、E4以及F8的部分結(jié)構(gòu)域共同組成了一個封閉的環(huán)，環(huán)繞ssDNA區(qū)域防止DNA底物的脫落，從而增加聚合酶的復(fù)制可持續(xù)性（圖2C）。

盡管H5是一個必需復(fù)制因子，它的分子角色一直不甚清楚。在四元復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，兩個H5二聚體進一步形成四聚體。四聚體通過一個末端與A22互作從而錨定在聚合酶全酶復(fù)合物中，同時以半圓形式環(huán)繞dsDNA。有趣的是，H5四聚體在痘病毒聚合酶中結(jié)合DNA的位置與PCNA結(jié)合DNA的位置類似，都位于酶活中心下游的dsDNA區(qū)域，表明H5可能也具有促進復(fù)制可持續(xù)性的功能（圖4）。該工作進一步結(jié)合生化實驗驗證了H5在復(fù)制過程中的這一功能。

在該論文撰寫及同行評議過程中，施一/高福團隊、董長江/張鄭宇團隊、鄢仁鴻團隊先后報道了猴痘病毒F8-A22-E4三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Li et al., 2023; Peng et al., 2023; Xu et al., 2023)，展示了三元復(fù)合物的亞基組織及其與DNA底物互作的分子細節(jié)。這些工作未涉及到此前功能未知的必需復(fù)制因子H5，也缺少UDGE4和DNA底物之間互作的結(jié)構(gòu)信息。這項工作通過一系列高分辨率的F8-A22-E4-H5結(jié)構(gòu)和功能實驗，揭示了H5四聚體增強聚合酶的持續(xù)性的分子功能，證明了E4在聚合酶復(fù)合物中具有堿基切除的催化活性。有意思的是，領(lǐng)域的前期工作表明痘病毒聚合酶不具備跨損傷合成活性（translesion synthesis）(Boyle et al., 2011)，表明E4在ssDNA模板上切除U堿基后產(chǎn)生的無堿基位點還需要進一步修復(fù)，否則將會影響四元復(fù)合物中F8所介導(dǎo)的DNA合成，這暗示著病毒完整的復(fù)制體還可能包括更多的堿基切除修復(fù)通路的因子。總體上，這項工作和其他團隊最近發(fā)表的相關(guān)工作一起為理解痘病毒獨特的DNA復(fù)制分子機制提供了重要的結(jié)構(gòu)和功能信息。值得一提的是，該論文提供的圖片被選為當期雜志的封面（圖5）。

圖5，Molecular Cell當期（Volume 83, Issue 23）的封面圖片。封面圖展示了猴痘病毒DNA聚合酶F8在病毒因子A22、E4和H5的幫助下進行DNA復(fù)制的分子機制。其中兩條螺旋纏繞的樹藤分別代表病毒基因組的模板DNA鏈和新生DNA鏈；建筑工人代表F8；紅色安全帶代表A22-E4，安全腳蹬代表H5，強調(diào)了A22-E4和H5分別以不同的分子機制增強F8的DNA復(fù)制可持續(xù)性

高寧和北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、PKU-THU生命科學(xué)聯(lián)合中心李寧寧副研究員為本文的共同通訊作者，生命科學(xué)學(xué)院2019級博士研究生王笑涵為本文**作者，前沿交叉學(xué)院2022級博士研究生馬靚雯（昌平實驗室研究生項目）也參與了這項工作。本研究得到生命科學(xué)聯(lián)合中心、國家自然科學(xué)基金、科技部重點研發(fā)計劃、昌平實驗室的經(jīng)費支持。這項工作的冷凍電鏡樣品檢查和數(shù)據(jù)收集主要在北京大學(xué)冷凍電鏡平臺完成，部分數(shù)據(jù)在水木未來（北京）科技有限公司收集。北京大學(xué)高性能計算平臺、生命科學(xué)學(xué)院儀器中心及國家蛋白質(zhì)基礎(chǔ)設(shè)施（北大分平臺）為該項目提供了重要的技術(shù)支撐。

本網(wǎng)站所有轉(zhuǎn)載文章系出于傳遞更多信息之目的，轉(zhuǎn)載內(nèi)容不代表本站立場。不希望被轉(zhuǎn)載的媒體或個人可與我們聯(lián)系，我們將立即進行刪除處理。