新研究闡釋猴痘病毒DNA聚合酶F8-A22-E4-H5四元復合物的工作機制

自2022年5月疫情暴發以來，猴痘在世界范圍內廣泛傳播，威脅人類健康。今年6月份以來，我國猴痘病例驟增，國家衛健委已將猴痘納入乙類傳染病管理。引發此次疫情的猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）屬于痘病毒科（Poxviridae family）正痘病毒屬（Orthopoxvirus genus），是一種大型、有包膜、雙鏈DNA病毒。該家族還有兩個熟知的成員，痘苗病毒（vaccinia virus）和天花病毒（variola virus）。DNA復制機器尤其是DNA聚合酶是抗正痘病毒藥物的重要靶標，該復合物高分辨率結構的解析能夠為抗猴痘藥物和疫苗的開發提供關鍵的結構基礎。

大部分DNA病毒在宿主細胞核內進行基因組的復制，而包括猴痘病毒在內的痘病毒的基因組復制在宿主胞質中完成，其DNA復制所需的關鍵蛋白因子主要由病毒基因組編碼，包括DNA聚合酶F8（猴痘病毒和痘苗病毒同源蛋白命名有一定差異，本文出現的蛋白因子均按猴痘病毒系統命名）、DNA解旋酶/引物酶E5、尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil-DNA glycosidase，UDG）E4、與E4共同組成聚合酶復制持續性因子（processivityfactor）異源二聚體的A22以及多功能磷酸化蛋白H5等。F8是DNA聚合酶復合物的核心催化亞基，但只能合成小于10堿基的小片段產物，A22-E4二聚體與F8形成穩定三元復合物，可以增強聚合酶復制的持續性，因此該三元復合物也被認為是痘病毒的DNA聚合酶全酶。此外，UDGE4可以識別并切除DNA中的尿嘧啶單堿基突變并啟動DNA修復途徑。UDG作為必需因子整合到聚合酶全酶中是痘病毒聚合酶所特有的，這種DNA合成和尿嘧啶堿基搜索/切除兩個過程耦合的機制尚不明確(Moss, 2013)。H5是一種多功能蛋白，也是痘病毒DNA復制的必需因子，但針對H5在DNA復制過程中的分子機制還完全不清楚(Boyle et al., 2015; McCraith et al., 2000)。

2023年12月7日，北京大學生命科學學院、PKU-THU生命科學聯合中心高寧教授課題組在Molecular Cell雜志最新一期發表題為“Structural insights into the assembly and mechanism of monkeypox virus DNA polymerase complex F8-A22-E4-H5”的研究論文，解析了猴痘病毒DNA聚合酶全酶四元復合物不同功能狀態的高分辨率結構，闡釋了這些病毒復制因子在DNA復制過程中的分子機制。

圍繞DNA聚合酶F8和UDGE4的功能，該工作通過在復合物中加入不同DNA底物的方式，捕捉到F8-A22-E4-H5四元復合物不同的構象狀態，包括聚合酶在工作過程中為維持復制保真性需要不斷轉換的經典的“open”和“closed”兩種構象狀態，以及UDGE4結合特異性底物（包含dU堿基的DNA）的催化后構象。作者對這些復合物樣品分別進行了冷凍電鏡結構解析，最高分辨率達到2.7 ?（圖2）。F8、A22和E4以1:1:1形式存在，而H5以四聚體形式結合在復合物中。A22含有四個結構域，呈U型結構分布。作為腳手架蛋白，A22同時介導了三個功能元件F8、E4和H5的整合，是聚合酶四元復合物組裝的核心元件。

UDGE4結合在單鏈模板DNA區域，位于聚合酶F8酶活中心上游（圖2C）。在添加有E4特異性DNA底物（-7位為尿嘧啶，dU-7）的四元復合物結構中，可以看到U堿基被切除（圖3A-B），形成一個無堿基的位點，表明聚合酶中的E4具有UDG酶活性，也再次從結構證明了痘病毒中DNA尿嘧啶單堿基修復和DNA合成過程是耦合在一起的。不同狀態的結構分析表明E4和F8的兩個活性中心之間具有7-10 nt的間隔（圖2C）。同其它UDG類似，以往的E4結構和功能研究主要以dsDNA底物為研究對象。作者**獲得了E4結合有ssDNA的結構，發現E4結合和作用于ssDNA的機制與dsDNA類似（圖3B-C）。

原核生物和真核生物經典的DNA聚合酶中的復制持續性因子PCNA結合在聚合酶活性中心下游的dsDNA區域（圖4A），環繞dsDNA防止DNA底物的脫落。在猴痘病毒聚合酶四元復合物結構中，已知的復制持續因子A22-E4結合在活性中心上游的模板ssDNA區域（圖2C），在分子機制上與PCNA完全不同。該工作的結構分析認為，A22-E4可能一方面通過E4與ssDNA的結合特性促進聚合酶與DNA底物的結合，另一方面A22、E4以及F8的部分結構域共同組成了一個封閉的環，環繞ssDNA區域防止DNA底物的脫落，從而增加聚合酶的復制可持續性（圖2C）。

盡管H5是一個必需復制因子，它的分子角色一直不甚清楚。在四元復合物結構中，兩個H5二聚體進一步形成四聚體。四聚體通過一個末端與A22互作從而錨定在聚合酶全酶復合物中，同時以半圓形式環繞dsDNA。有趣的是，H5四聚體在痘病毒聚合酶中結合DNA的位置與PCNA結合DNA的位置類似，都位于酶活中心下游的dsDNA區域，表明H5可能也具有促進復制可持續性的功能（圖4）。該工作進一步結合生化實驗驗證了H5在復制過程中的這一功能。

在該論文撰寫及同行評議過程中，施一/高福團隊、董長江/張鄭宇團隊、鄢仁鴻團隊先后報道了猴痘病毒F8-A22-E4三元復合物的結構(Li et al., 2023; Peng et al., 2023; Xu et al., 2023)，展示了三元復合物的亞基組織及其與DNA底物互作的分子細節。這些工作未涉及到此前功能未知的必需復制因子H5，也缺少UDGE4和DNA底物之間互作的結構信息。這項工作通過一系列高分辨率的F8-A22-E4-H5結構和功能實驗，揭示了H5四聚體增強聚合酶的持續性的分子功能，證明了E4在聚合酶復合物中具有堿基切除的催化活性。有意思的是，領域的前期工作表明痘病毒聚合酶不具備跨損傷合成活性（translesion synthesis）(Boyle et al., 2011)，表明E4在ssDNA模板上切除U堿基后產生的無堿基位點還需要進一步修復，否則將會影響四元復合物中F8所介導的DNA合成，這暗示著病毒完整的復制體還可能包括更多的堿基切除修復通路的因子。總體上，這項工作和其他團隊最近發表的相關工作一起為理解痘病毒獨特的DNA復制分子機制提供了重要的結構和功能信息。值得一提的是，該論文提供的圖片被選為當期雜志的封面（圖5）。

圖5，Molecular Cell當期（Volume 83, Issue 23）的封面圖片。封面圖展示了猴痘病毒DNA聚合酶F8在病毒因子A22、E4和H5的幫助下進行DNA復制的分子機制。其中兩條螺旋纏繞的樹藤分別代表病毒基因組的模板DNA鏈和新生DNA鏈；建筑工人代表F8；紅色安全帶代表A22-E4，安全腳蹬代表H5，強調了A22-E4和H5分別以不同的分子機制增強F8的DNA復制可持續性

高寧和北京大學生命科學學院、PKU-THU生命科學聯合中心李寧寧副研究員為本文的共同通訊作者，生命科學學院2019級博士研究生王笑涵為本文**作者，前沿交叉學院2022級博士研究生馬靚雯（昌平實驗室研究生項目）也參與了這項工作。本研究得到生命科學聯合中心、國家自然科學基金、科技部重點研發計劃、昌平實驗室的經費支持。這項工作的冷凍電鏡樣品檢查和數據收集主要在北京大學冷凍電鏡平臺完成，部分數據在水木未來（北京）科技有限公司收集。北京大學高性能計算平臺、生命科學學院儀器中心及國家蛋白質基礎設施（北大分平臺）為該項目提供了重要的技術支撐。

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