DNA引物酶促進(jìn)轉(zhuǎn)錄復(fù)制間的競爭并影響基因組穩(wěn)定性的新機(jī)制

轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是生物體維持和傳遞遺傳信息的重要事件，它們以同一套基因組為模板，因而常會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄-復(fù)制對撞，誘發(fā)R-loop積累和DNA斷裂，導(dǎo)致基因組損傷。R-loop是由雜合雙鏈RNA:DNA和單鏈DNA組成的三鏈核酸結(jié)構(gòu)，其過量積累會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，因此生物體進(jìn)化出了一系列機(jī)制調(diào)控基因組內(nèi)R-loop的水平。其中核糖核酸酶RNase H能夠特異消化RNA:DNA雜合鏈中的RNA，從而清除R-loop，維持基因組穩(wěn)定。

2024年1月2日，生命中心孫前文實(shí)驗(yàn)室在《自然·通訊》(Nature Communications)雜志上發(fā)表了題為“引物酶促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制在同一模板鏈上的競爭從而導(dǎo)致DNA損傷” (Primase promotes the competition between transcription and replication on the same template strand resulting in DNA damage)的研究論文。該研究揭示了擬南芥葉綠體DNA復(fù)制引物酶促進(jìn)葉綠體基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制競爭和R-loop積累，從而誘發(fā)葉綠體基因組斷裂的分子機(jī)制。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場所，孫前文實(shí)驗(yàn)室前期鑒定了擬南芥基因組編碼的三個(gè)RNase H1蛋白，并發(fā)現(xiàn)定位于葉綠體的AtRNH1C蛋白可以與DNA Gyrase（拓?fù)洚悩?gòu)酶）互作解除葉綠體基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制對撞，清除R-loop，減少DNA的損傷。atrnh1c突變體的葉綠體基因組內(nèi)R-loop過量積累，高轉(zhuǎn)錄復(fù)制對撞區(qū)域DNA斷裂增多，從而引發(fā)葉片黃化，植物矮小的表型（Yang et al., The Plant Cell 2017）。

為進(jìn)一步探究參與基因組穩(wěn)定性和R-loop調(diào)控的新因子，孫前文實(shí)驗(yàn)室對atrnh1c突變體進(jìn)行EMS誘變篩選，獲得多個(gè)表型抑制突變體。其中acs1（atrnh1c suppressor 1）突變體無論是葉片顏色，光合效率，以及葉綠體的數(shù)目和形態(tài)，與atrnh1c相比均有顯著恢復(fù)（圖1a和b）。通過基因定位和功能驗(yàn)證鑒定到ACS1基因編碼一個(gè)葉綠體和線粒體雙向定位的引物酶ATH（圖1c-f）。引物酶在DNA復(fù)制過程中合成小的RNA片段，引導(dǎo)合成新的DNA鏈。

在acs1突變體中，ATH蛋白的一個(gè)跨物種間高度保守的氨基酸發(fā)生替換，導(dǎo)致蛋白與DNA模板的結(jié)合能力變?nèi)?，合?/span>RNA引物以及介導(dǎo)DNA復(fù)制酶合成DNA的能力下降，從而減緩了轉(zhuǎn)錄-復(fù)制對撞和R-loop積累，使得atrnh1c突變體的表型缺陷發(fā)生一定程度的恢復(fù)（圖2a-c）。通過鏈特異性的DNA斷裂測序發(fā)現(xiàn)，在葉綠體基因組中高轉(zhuǎn)錄復(fù)制對撞的rDNA區(qū)域，轉(zhuǎn)錄和后隨鏈的復(fù)制在同一條DNA鏈上進(jìn)行，這條鏈的轉(zhuǎn)錄本末端存在特異且較高程度的單鏈DNA斷裂（圖2d和e）。通過構(gòu)建葉綠體DNA復(fù)制酶Pol1A與AtRNH1C的雙突材料1cpol1a，進(jìn)一步驗(yàn)證了減緩復(fù)制可以減輕轉(zhuǎn)錄-復(fù)制對撞和R-loop積累，從而維持基因組穩(wěn)定，恢復(fù)atrnh1c突變表型。 此外，作者發(fā)現(xiàn)超表達(dá)引物酶ATH會(huì)促進(jìn)葉綠體基因組中R-loop過量積累，誘發(fā)DNA斷裂，并引起植株產(chǎn)生新葉黃化的表型（圖3 a和b）；而通過基因編輯敲除ATH則會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，胚胎發(fā)育停滯在球形胚期（圖3 c-f）。這些結(jié)果表明細(xì)胞器中的引物酶ATH對于擬南芥的正常生長發(fā)育不可或缺。

綜上，本研究通過篩選擬南芥葉綠體中高度積累R-loop的atrnh1c突變體的回復(fù)突變，揭示了引物酶在調(diào)控基因組轉(zhuǎn)錄復(fù)制對撞中的作用，對于研究其他物種中的R-loop和基因組穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制具有借鑒意義。同時(shí)，本研究也證實(shí)了擬南芥細(xì)胞器引物酶ATH的適當(dāng)表達(dá)水平對于植物的生長發(fā)育的重要性。

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后張衛(wèi)峰為該論文**作者，孫前文副教授為本文通訊作者，孫前文實(shí)驗(yàn)室已畢業(yè)博士生楊卓和已出站博士后王文杰也參與了該項(xiàng)研究。該工作得到國家自然科學(xué)基金、生命科學(xué)聯(lián)合中心、中國博士后科學(xué)基金等經(jīng)費(fèi)的支持。

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