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DIY外泌體專用血清的常用方法

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發表時間：2022-11-15 14:08

　　各位小伙伴們，晚上好！

　　今天文章的主題是無外泌體血清。

　　外泌體大家應該都很熟悉。1983年，在綿羊網織紅細胞中**發現了現在生物學研究領域炙手可熱的“小網紅”——一種特殊囊泡結構，并與1987年正式被命名為“exosome”。

　　外泌體是指包含了復雜 RNA 和蛋白質的小膜泡 (30-150nm)，現今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。為細胞間通訊的重要媒介，它像一個信使，為細胞與胞外環境傳遞信息，保障機體的正常工作。

　　越來越多的科研人員投入到外泌體的研究中，根據PubMed統計顯示，最近幾年，外泌體研究呈爆炸增長。

　　外泌體的研究離不開細胞培養。以腫瘤相關外泌體研究為例，目前，收集腫瘤細胞外泌體主要有兩種方法：

　　方法一

　　使用正常培液養細胞再換無血清培液收外泌體。

　　方法二

　　直接使用exosome-free FBS配制培養基用于培養細胞收外泌體。

　　從現有的一些研究可以看出[1][2][3][4][5]，研究人員更傾向于方法二，也就是使用exosome-free FBS培養細胞再收上清分離exosomes的方法，至少腫瘤研究方面是這樣的。

　　相關文獻在這里

　　向上滑動閱覽

　　[1] Zhou W , Fong M , Min Y , et al. Cancer-Secreted miR-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis[J]. Cancer Cell, 2014.

　　[2] Boelens M , Wu T , Nabet B , et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways[J]. Cell, 2014, 159(3):499-513.

　　[3] Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver[J]. Nature Cell Biology, 2015, 17(6):816-826.

　　[4] Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J]. Nature, 2020, 2015，527(7578):329-35.

　　[5] Melo S A , Luecke L B , Kahlert C , et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J]. Nature, 2015, 523(7559):177-182.

　　所以，接下來就不得不講講exosome-free FBS——無外泌體血清了。

　　顧名思義，無外泌體血清就是外泌體含量極低，低到幾乎沒有的血清（以粒徑分析結果為標準），獲得主要有兩種途徑：

　　直接購買商品化的產品

　　自己DIY制備

　　如果選擇自己制備無外泌體血清，最常用的方法就是超速離心法。主要有三種策略：（前提是將血清用正確的方法徹底解凍，分裝）

　　1、將血清與培養基1：4比例稀釋，然后超速離心10000g過夜收集上清；

　　2、直接將血清速離心10000g過夜收集上清；

　　3、180000g離心3-6小時收集上清。

　　P.S.其中，離心的過夜時間要視情況而定，一般在10-14小時之間，也可適當延長離心時間。

　　需要注意的是，離心后，外泌體會富集在試管底部，在吸取上層血清的時候，不要觸碰底部沉淀，避免吸到沉底的外泌體，“一夜回到解放前”。

　　另外，只吸取80%左右的上層血清，其余的渾濁血清留作其他非外泌體用途細胞的培養，畢竟血清也挺貴的，避免不必要的浪費。

　　針對超速離心后的血清，可進行粒徑檢測（離心前樣品和離心后樣品），如果覺得純度不夠，再把離心后收集的血清做二次超速離心。