DNA提取對(duì)支原體檢測(cè)qPCR法實(shí)驗(yàn)中重要嗎？

支原體放行檢測(cè)，在臨床相關(guān)的項(xiàng)目中發(fā)揮著重要作用。常見的一些研究，如干細(xì)胞治療項(xiàng)目、免疫細(xì)胞治療項(xiàng)目研究、CAR-T項(xiàng)目研究、抗體藥研究、疫苗等領(lǐng)域，以及還有一些重要的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞典藏項(xiàng)目，都需要對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞或收獲的產(chǎn)物，進(jìn)行準(zhǔn)確度較高的支原體檢測(cè)，以保證產(chǎn)物沒有支原體污染。

qPCR法是十分常用的支原體檢測(cè)方法。藥典中指出，通過方法學(xué)驗(yàn)證，即在檢測(cè)限、特異性和耐用性等方面達(dá)到要求后，才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。因此，qPCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的穩(wěn)定性與精準(zhǔn)度，直接關(guān)系到方法學(xué)驗(yàn)證是否可信。

除了實(shí)驗(yàn)操作、所選擇的試劑盒等常見的影響因素，待檢樣品的預(yù)處理方法，也會(huì)對(duì)qPCR檢測(cè)結(jié)果造成不同程度的影響。

用于支原體檢測(cè)的樣品的成分通常比較復(fù)雜，可能存在抑制PCR的物質(zhì)，影響qPCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在進(jìn)行qPCR檢測(cè)之前，需要將樣品中的支原體DNA純化出來，以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。

進(jìn)行DNA提取的優(yōu)勢(shì)：

1、提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性：DNA提取可以有效地從復(fù)雜樣品中分離出支原體的DNA，避免雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，降低假陽性結(jié)果的可能性。

2、增加檢測(cè)的靈敏度：通過DNA提取，可以將支原體的DNA濃縮到較高的水平，使其在qPCR中的檢測(cè)限度更低，提高了檢測(cè)的靈敏度，即能夠檢測(cè)到更低濃度的支原體。

3、節(jié)省成本：雖然DNA提取可能需要一定的時(shí)間和成本，但它可以避免由于假陽性結(jié)果而帶來的額外成本，如錯(cuò)誤的結(jié)果導(dǎo)致方法學(xué)驗(yàn)證失敗等。

因此，當(dāng)待檢樣品如果存在以下幾種情況（包括但不限于），需要對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取處理，以提高支原體檢測(cè)的靈敏度：

1、細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度如果超過12%，那么對(duì)下游的PCR反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生抑制。酚紅，對(duì)熒光定量PCR的檢測(cè)也會(huì)干擾。這些均可以通過使用德國Miverva Biolabs公司的支原體DNA提取試劑盒來解決。

2、對(duì)于樣品類型是細(xì)胞團(tuán)、疫苗、凍存細(xì)胞和石蠟包埋的組織，需要提前提取DNA。

3、如果樣品中蛋白含量高于10mg/ml，則先需要用蛋白酶K進(jìn)行處理，再用原體DNA提取試劑盒提取樣品中的DNA。

德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Venor?GeM Sample preparation Kit支原體DNA提取試劑盒，可實(shí)現(xiàn)支原體檢測(cè)方法驗(yàn)證過程中的樣品制備步驟，包括DNA提取和純化，可防止可能干擾qPCR擴(kuò)增的污染物或抑制劑的引入。從細(xì)胞上清和生物制品中分離支原體DNA，全程只需30分鐘。該試劑盒的操作分四步：細(xì)胞溶解，DNA特異性與層析柱結(jié)合，祛除殘留的污染物和抑制劑，洗脫DNA。

該試劑盒符合歐洲藥典規(guī)范，配合支原體qPCR檢測(cè)試劑盒、支原體標(biāo)準(zhǔn)品一起使用，通過歐洲藥典的方法學(xué)驗(yàn)證，助力新藥上市。