熒光定量PCR試劑盒說明書和操作步驟

支原體熒光定量PCR法是一種基于熒光定量PCR技術(shù)的檢測方法，專門用于支原體的檢測。這種方法在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，將針對支原體特異性保守序列的探針進行熒光標(biāo)記，使得PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光。利用熒光信號的變化和配套軟件，可以實時監(jiān)測DNA擴增反應(yīng)，即實時熒光定量PCR（qPCR）。

熒光定量pcr試劑盒說明書和使用方法

德國MB公司生產(chǎn)的熒光定量PCR試劑盒（均為探針法檢測），依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別， 分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。   

此兩類試劑盒較全球其他廠家同類產(chǎn)品，具有以下獨特的優(yōu)點：

①經(jīng)典法熒光定量PCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性，一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測到107種支原體物種。操作簡單，易于觀察（使用MB的試劑盒，下表中列出的支原體物種均為陽性，其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性，無交叉反應(yīng)）。

③高靈敏度，MB公司的支原體熒光定量PCR試劑盒經(jīng)典法最低檢測限可達(dá)到≤10CFU/ml。

MB公司的支原體qPCR檢測試劑盒一步法最低檢測限≥50個基因組/反應(yīng)。

④MB公司有相應(yīng)配套的10CFU/100CFU的敏感度測試的標(biāo)準(zhǔn)品，便于方法學(xué)驗證。

⑤MB公司有相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗證。

⑥MB公司有相應(yīng)配套的支原體絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測。

熒光定量PCR試劑盒特點

1.內(nèi)控對照為獨立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

2.高特異性，一次檢測即可涵蓋所有常見易感染細(xì)胞的支原體物種（包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）。與細(xì)菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

3.高靈敏度，最低檢測限可達(dá)到≤10CFU/ml。

4.相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗證。

5.有相應(yīng)配套的支原體絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測。

熒光定量PCR試劑盒操作步驟

第1步：樣本處理

a.細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明：①樣品基質(zhì)可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

    ②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理，實現(xiàn)最高靈敏度。

推薦：德國MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒

Venor? Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過廣泛驗證。

第2步：試劑制備

a.凍干粉溶解

b. 反應(yīng)體系制備

b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備

b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備

第3步：啟動熒光定量PCR儀

第4步：結(jié)果判別

FAM通道：檢測支原體熒光信號。HEX通道：檢測內(nèi)控對照熒光信號。

支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號的競爭性抑制。

支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號越高，檢測內(nèi)控對照的HEX通道信號越低。

定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。

示意圖：

主要用途

熒光定量PCR試劑盒主要用于基因組DNA靶序列和RNA反轉(zhuǎn)錄后cDNA靶序列的檢測。

保存與使用

保存條件：試劑盒通常需要在低溫下保存，2~8℃保存至少12個月。復(fù)溶后-18℃以下保存。

注意事項

請務(wù)必遵照產(chǎn)品說明書的儲存條件和使用方法，否則無法保證試劑盒的性能和保質(zhì)期。

試劑盒在使用過程中，應(yīng)避免污染和交叉污染，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。