研究發(fā)現(xiàn)，RNA適配體RhoBAST結(jié)合與激活熒光團(tuán)TMR-DN的機(jī)制

在活細(xì)胞中對生物大分子，如蛋白質(zhì)和RNA等進(jìn)行時(shí)空定位和追蹤，對于理解它們的生物學(xué)功能和揭示其機(jī)制至關(guān)重要。綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)顯著提高了活細(xì)胞內(nèi)功能性蛋白成像的適用性。目前，熒光點(diǎn)亮RNA適配體 (FLAP) 已作為熒光蛋白的對應(yīng)物應(yīng)用于細(xì)胞中功能RNA的成像。FLAP通常是利用體外進(jìn)化篩選技術(shù)得到的一段RNA序列，其結(jié)合配體后能顯著增強(qiáng)配體的熒光。由于其高亮度、更好的可編程性和較小的尺寸，FLAP被認(rèn)為是強(qiáng)有力的活細(xì)胞RNA熒光成像工具。

近年來，RhoBAST、biRhoBAST、o-Coral、SiRA等一系列FLAP因其在RNA超分辨率成像中的優(yōu)異表現(xiàn)而受到廣泛關(guān)注。這些FLAP均可結(jié)合羅丹明的衍生物。羅丹明是一種熒光染料，以超高的光穩(wěn)定性、亮度和良好的膜滲透性而廣泛用于生物成像。研究表明，RhoBAST可以結(jié)合并激活一種接觸淬滅型羅丹明衍生物TMR-DN (發(fā)光團(tuán)TMR和淬滅劑DN的耦聯(lián)化合物)，因其良好的折疊性能、高親和力、配體快速交換、超高亮度、優(yōu)異的光穩(wěn)定性等多種特征，在RNA的超分辨率成像中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。然而，RhoBAST結(jié)合和激活熒光染料的結(jié)構(gòu)機(jī)制還不清楚。

2024年5月17日，中國科學(xué)院生物物理研究所方顯楊研究組與動物研究所李幸研究組合作在《Nature Communications》上發(fā)表了題為"Structural mechanisms for binding and activation of a contact-quenched fluorophore by RhoBAST"的研究論文。在該項(xiàng)研究中，研究人員通過整合X射線晶體學(xué)、小角X射線散射、分子動力學(xué)模擬等方法，揭示了RhoBAST的結(jié)構(gòu)及其結(jié)合與激活TMR-DN的分子機(jī)制。

研究人員首先應(yīng)用X射線晶體學(xué)解析了RhoBAST與TMR-DN復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)RhoBAST折疊成一種四分支結(jié)構(gòu)(four-way junction)，整體結(jié)構(gòu)類似于不對稱的"A"字形(圖a)。TMR的蒽雜環(huán)嵌入到位于"A"字形頂端的半開放結(jié)合口袋，而DN堆積在TMR的苯環(huán)上。有趣的是，盡管TMR-DN與RhoBAST的相對結(jié)合面積普遍要小于絕大多數(shù)的FLAPs (圖b-c)，但是RhoBAST與TMR-DN卻有著較高的親和力(K_D ≈ 30 nM)。小角X射線散射實(shí)驗(yàn)表明RhoBAST的折疊不依賴于配體分子，這顯著區(qū)別于絕大數(shù)的FLAP結(jié)構(gòu)，通常這些FLAP的折疊依賴配體的結(jié)合。通過與其它FLAP的折疊結(jié)構(gòu)和結(jié)合模式的比較，研究人員推測,可能由于RhoBAST的結(jié)合口袋遠(yuǎn)離折疊中心，因而其折疊不依賴配體。同時(shí)，這也賦予了RhoBAST結(jié)構(gòu)的剛性，使其與TMR-DN的結(jié)合更像是鎖-鑰模式。類似的，一種識別花菁染料的適配體DIR2s也具有近似的結(jié)構(gòu)特征(圖b)，也展示出不依賴配體結(jié)合的折疊模式。由于RhoBAST的結(jié)構(gòu)剛性，它與配體結(jié)合過程中較少的構(gòu)象熵?fù)p失彌補(bǔ)了它們之間相對較弱的相互作用，使其仍然具有較高的配體結(jié)合親和力。RhoBAST的結(jié)構(gòu)剛性以及半開放的結(jié)構(gòu)口袋的特征可能還賦予它與配體快速交換的動力學(xué)性能，其要比其它FLAPs如pepper系統(tǒng)至少快兩個數(shù)量級以上，因此可以通過與溶液中新鮮配體的快速交換來很好地避免光漂白問題，使其在熒光超分辨成像展現(xiàn)出優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)。

為了更好地理解RhoBAST對TMR-DN的激活機(jī)制，研究人員采用增強(qiáng)采樣的分子動力學(xué)模擬方法表征了TMR-DN在自由以及與RhoBAST結(jié)合狀態(tài)下的構(gòu)象空間。結(jié)果表明，無論是自由還是結(jié)合狀態(tài)下，TMR-DN都呈現(xiàn)出一種高度動態(tài)的構(gòu)象特征，其中接觸-非堆疊構(gòu)象占據(jù)所有接觸類型中的多數(shù)(圖d)。未結(jié)合狀態(tài)下，淬滅劑DN與發(fā)光團(tuán)TMR接觸比例達(dá)到90%，DN偏向與其中的蒽雜環(huán)接觸。此時(shí)絕大多數(shù)的TMR-DN處于自淬滅狀態(tài)(熒光量子產(chǎn)率 Φ_F=0.08)。與RhoBAST結(jié)合后，DN與蒽雜環(huán)的接觸被抑制，其與TMR的接觸比例顯著下降到60%左右，因此只有部分TMR-DN被激發(fā)，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道該體系在結(jié)合狀態(tài)下只有中等熒光量子產(chǎn)率(Φ_F=0.57)的觀測是大致相符的。

總之，該項(xiàng)工作通過整合多種研究方法揭示了RhoBAST的結(jié)構(gòu)及其結(jié)合與激活一種熒光淬滅型熒光團(tuán)TMR-DN的機(jī)制，進(jìn)一步通過比較相關(guān)FLAP的結(jié)構(gòu)和結(jié)合模式，為理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化這一重要的FLAP系統(tǒng)提供了機(jī)制見解。

本網(wǎng)站所有轉(zhuǎn)載文章系出于傳遞更多信息之目的，轉(zhuǎn)載內(nèi)容不代表本站立場。不希望被轉(zhuǎn)載的媒體或個人可與我們聯(lián)系，我們將立即進(jìn)行刪除處理。