不依賴模板的RNA寡核苷酸酶合成

　　雖然COVID-19疫苗使許多人接觸到基于RNA的藥物，但RNA寡核苷酸已經在市場上用于治療杜氏肌營養不良癥和淀粉樣變性等疾病多年。與傳統的小分子藥物相比，RNA療法具有許多優勢，包括它們能夠處理細胞內幾乎任何遺傳成分，并引導CRISPR等基因編輯工具到達目標。

　　然而，核糖核酸的前景目前受到全球快速增長的需求超過該行業生產能力的限制。化學合成RNA的標準方法是在20世紀80年代發明的，需要專門的設備和勞動密集型的過程。化學合成方法也受到核苷酸構建塊范圍的限制，它們可以結合到RNA分子中，并且它們會產生大量有毒的化學副產品，造成環境危害并限制工廠的生產能力。這些問題只會隨著RNA產量的增加而增加。

　　哈佛大學威斯研究所和哈佛醫學院(HMS)的一組科學家為這個問題創造了一個解決方案:這是一種新的RNA合成工藝，擴大了RNA治療的設計空間，釋放了化學合成無法實現的快速放大的潛力。他們的新方法可以用水和酶來生產RNA，其效率和純度與目前的工業標準相當，而不是困擾當前制造業的有毒溶劑和爆炸性催化劑。它還可以結合目前在RNA藥物中發現的所有常見分子修飾，并有可能結合新型RNA化學物質用于新型療法。今天發表在《自然生物技術》上的一篇論文描述了這一成就。

　　“隨著對RNA藥物的需求持續增長和更多產品進入市場，我們將超過目前全球乙腈的供應，乙腈是化學RNA合成方法中使用的有機溶劑，”共同**作者Jonathan Rittichier博士說，他是Wyss和HMS的前博士后研究員。他和**作者、前威斯研究所科學家丹尼爾·維根(Daniel Wiegand)， m.s.c.e.。， Wyss Core教員George Church博士和其他人共同創立了EnPlusOne Biosciences，將他們的技術商業化。“以這種規模向世界提供RNA藥物需要一種可再生的水合成模式的轉變，我們相信我們的專有酶技術將實現這一轉變。”

　　一種更好、更環保的方式

　　在丘奇的實驗室里，Rittichier、Wiegand和共同通訊作者Erkin Kuru博士認識到制藥行業正處于RNA革命之中。該實驗室之前設計了一種使用酶合成DNA的方法，并假設他們可以對RNA做同樣的事情。

　　科學家們從一種酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)中的酶開始研究，這種酶可以將核苷酸分子連接在一起，形成RNA鏈。他們設計了這種酶，使其更有效，能夠將非標準核苷酸結合到RNA中。這對于建立一個有用的藥物開發平臺尤其重要，因為每一種經fda批準的RNA藥物都含有經過修改的核苷酸，以增加其在體內的穩定性或賦予其新的功能。

　　然后他們把注意力集中在核苷酸本身。在標準的化學RNA合成中，核苷酸上添加了“保護基團”:一種化學氣泡膜，可以防止分子在惡劣的反應條件下被破壞。為了使RNA發揮作用，這些保護基團需要在合成后被移除，這個過程需要額外的一輪化學反應，這些化學反應會在RNA被構建時破壞它。EnPlusOne合成的溫和條件消除了任何笨重的氣泡包裝的需要，最終導致更好的制造。

　　但即使它解決了一個問題，該團隊的酶也帶來了一個不同的問題:它的自然活性會不受控制地將核苷酸串在一起，導致不準確的RNA序列。為了解決這個問題，他們用一種“阻滯劑”來修飾核苷酸，這是一種化學基團，可以阻止酶，一次只允許添加一個核苷酸。一旦加入所需的核苷酸，阻斷劑被移除以允許序列中的下一個核苷酸結合，從而產生兩步過程，比典型的四步化學合成方法更簡單，試劑密集度更低。

　　研究人員證明，他們的新工藝以95%的效率結合了核苷酸，這與化學合成相當。然后，研究小組反復重復酶促RNA合成的循環，以構建長度為10個核苷酸的分子。他們現在通常能夠構建23個核苷酸長的分子，這是許多暢銷RNA療法的大小。

　　從分子到藥物

　　將RNA轉化為有用藥物的關鍵是修改其自然存在的核苷酸。該團隊還證明，他們的酶合成方法可以成功地產生具有多種修飾核苷酸的RNA鏈，其能力與天然核苷酸相同。“天然RNA是由四個字母組成的——A、U、C和G——但我們可以用合成生物學來擴展這個簡單的字母，”HMS的博士后研究員庫魯說。“我們的過程基本上增加了我們‘RNA打字機’上的鍵的數量，使我們可以用更豐富的字母來編寫具有新功能和特性的RNA。”

　　這項工作為2019年和2020年Wyss研究所的驗證項目奠定了基礎，當時它被去風險并準備商業化。同樣在2020年，該項目成為**個通過Wyss研究所與Northpond實驗室(生物工程研究與創新實驗室)合作支持的項目，該項目基于其對現實世界的重大影響的潛力。EnPlusOne Biosciences于2022年成立，旨在將這種新方法商業化，并將酶促RNA合成推向世界。融資由Northpond Ventures領投，Breakout Ventures和Coatue參與。

　　酶促核苷酸合成技術作為化學合成方法的替代方案具有許多優點。該平臺可以幫助以可持續的方式釋放RNA治療的巨大潛力，特別是為CRISPR/Cas基因編輯制造高質量的指導RNA分子，”共同通訊作者Church說，他也是HMS的Robert Winthrop遺傳學教授。

　　EnPlusOne還利用其平臺在實驗室規模上制造可用于治療多種疾病的小干擾rna (sirna)。

　　“RNA藥物為一系列疾病提供了強有力的新治療方法。然而，目前這些藥物的制造方法是有限的，因為它們可以生產的化學多樣性，可以以合理的成本生產的材料數量，以及它們對環境的負面影響，因為它們需要苛刻的化學物質。“EnPlusOne優雅的生物啟發酶合成替代方案提供了一種克服所有這些限制的方法，并可能幫助RNA治療行業爆發，”Wyss創始董事Don Ingber博士說。Ingber也是HMS和波士頓兒童醫院的Judah Folkman血管生物學教授，以及哈佛大學John a . Paulson工程與應用科學學院(SEAS)的Hansj?rg Wyss生物啟發工程教授。

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