支原體檢測(cè)試劑盒qpcr法引物序列

關(guān)于支原體檢測(cè)試劑盒qPCR法中的引物序列，由于不同品牌、不同型號(hào)的試劑盒可能采用不同的引物設(shè)計(jì)，今天介紹的是德國(guó)MB生產(chǎn)的支原體檢測(cè)試劑盒qPCR法的詳細(xì)介紹，包括引物序列、操作步驟等。

引物在支原體qPCR檢測(cè)中扮演著至關(guān)重要的角色。它們決定了檢測(cè)的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性。良好的引物設(shè)計(jì)可以確保只擴(kuò)增目標(biāo)支原體的DNA序列，從而避免非特異性擴(kuò)增和假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（均為探針?lè)z測(cè)），依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別， 分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。   

此兩類(lèi)試劑盒較全球其他廠家同類(lèi)產(chǎn)品，具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：

①經(jīng)典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測(cè)到107種支原體物種。操作簡(jiǎn)單，易于觀察（使用MB的試劑盒，下表中列出的支原體物種均為陽(yáng)性，其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)）。

③高靈敏度，MB公司的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒經(jīng)典法最低檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。

MB公司的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒一步法最低檢測(cè)限≥50個(gè)基因組/反應(yīng)。

④MB公司有相應(yīng)配套的10CFU/100CFU的敏感度測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)品，便于方法學(xué)驗(yàn)證。

⑤MB公司有相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗(yàn)證。

⑥MB公司有相應(yīng)配套的支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測(cè)。

支原體qPCR檢測(cè)試劑盒特點(diǎn)

1.內(nèi)控對(duì)照為獨(dú)立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

2.高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋所有常見(jiàn)易感染細(xì)胞的支原體物種（包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）。與細(xì)菌和真核DNA無(wú)交叉反應(yīng)。

3.高靈敏度，最低檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。

4.相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗(yàn)證。

5.有相應(yīng)配套的支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測(cè)。

支原體qPCR檢測(cè)試劑盒操作步驟

第1步：樣本處理

a.細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說(shuō)明：①樣品基質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測(cè)定靈敏度。

    ②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測(cè)靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理，實(shí)現(xiàn)最高靈敏度。

推薦：德國(guó)MB公司生產(chǎn)的專(zhuān)用支原體DNA提取試劑盒

Venor? Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過(guò)廣泛驗(yàn)證。

第2步：試劑制備

a.凍干粉溶解

b. 反應(yīng)體系制備

b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備

b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備

第3步：?jiǎn)?dòng)熒光定量PCR儀

第4步：結(jié)果判別

FAM通道：檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。HEX通道：檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照熒光信號(hào)。

支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高，檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。

定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ct＜40為陽(yáng)性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。

示意圖：

儲(chǔ)存條件

2~8℃保存至少12個(gè)月。復(fù)溶后-18℃以下保存。