PCR Clean?祛除RNases的效果檢測(cè)

科研人員測(cè)試了PCR Clean?（噴霧和預(yù)濕濕巾）祛除玻璃表面RNases的能力。

簡(jiǎn)單地說(shuō)，將RNase A（5μl，0.03 U/ml甘油，Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）轉(zhuǎn)移到先前凈化過(guò)的玻璃表面上，并在室溫下孵育30分鐘。

接下來(lái)，用干燥紙巾、PCR Clean? Wipes或用含有70%異丙醇、PCR Clean?或市售的RNase去污劑RNaseZap?（Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）的紙巾擦拭實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，15秒接觸時(shí)間后可重復(fù)擦拭。

在控制條件下進(jìn)行RNase污染后，50μl無(wú)核酸酶的H₂O (Thermo Fisher Scientific, Cat； No.AM1964)添加到預(yù)污染點(diǎn)并上下移液10次以收集任何存在的RNase。

然后將這些樣品中的45μl用于市售的熒光檢測(cè)RNaseAlert?（Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）。該試劑盒是按照制造商的建議使用的。隨后，在37°C孵育期間測(cè)量原始熒光（ex 490/em 520），最多每5分鐘一次。使用CFX96 Touch?（Bio-Rad） 2小時(shí)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在表面清潔或未清潔后，使用市售的基于熒光的RNase活性測(cè)定來(lái)評(píng)估RNase的有效祛除。在分析之前，通過(guò)徹底的點(diǎn)移液對(duì)表面進(jìn)行取樣，包括省略RNase（陰性對(duì)照）或擦拭（陽(yáng)性對(duì)照）的表面，并用基于熒光的方法RNaseAlert?（ThermoFisher Scientific）進(jìn)行分析。在未進(jìn)行擦拭的樣品中，始終觀察到嚴(yán)重污染的RNase活性（圖6A，紫色曲線，代表性結(jié)果）。與陰性對(duì)照組一樣，當(dāng)沒有測(cè)量到RNase的殘留活性時(shí)，認(rèn)為凈化完成。

就熒光信號(hào)而言，根據(jù)試劑盒制造商的建議，將截止值定義為陰性對(duì)照熒光的2.5倍（圖6A，紅色虛線）。基于該參數(shù)，在至少2或3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，省略擦拭步驟、使用干紙巾或用70%異丙醇潤(rùn)濕的毛巾不會(huì)抑制RNase的活性（表6和圖6）。為了更好地突出陰性對(duì)照和其他清潔方法之間的差異，圖6B中顯示了圖6A（黑色矩形）的相應(yīng)縮放區(qū)域。只有在用PCR Clean?（預(yù)濕濕巾和浸濕的紙巾）或RNaseZap?浸濕的紙巾擦拭后，才能實(shí)現(xiàn)顯著和可重復(fù)的去污，即使在37°C下孵育2小時(shí)后，熒光水平也很低（圖6和表6）。