干貨分享：熒光定量PCR原理和操作步驟

熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）是一種在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。以下是熒光定量PCR的原理和步驟的詳細(xì)解釋：

一、熒光定量PCR原理

熒光定量PCR的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR過(guò)程中合成新DNA鏈的特性，結(jié)合一種熒光標(biāo)記的探針或染料，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的增加來(lái)測(cè)量PCR反應(yīng)的進(jìn)行程度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶DNA的定量分析。

在PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針（如TaqMan熒光探針），該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。開(kāi)始時(shí)，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶（具有5'-3'外切酶活性）將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

另外，熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)也可分為熒光染料（如SYBR熒光染料）和熒光探針兩類。在PCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺?/span>DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線確定PCR反應(yīng)是否特異。

二、熒光定量PCR步驟

熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)步驟通常包括反轉(zhuǎn)錄（如檢測(cè)RNA樣品時(shí)）、擴(kuò)增和檢測(cè)三個(gè)主要階段。以下是具體步驟：

反轉(zhuǎn)錄（如適用）：對(duì)于RNA樣品，首先需要使用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增：在PCR反應(yīng)管中加入適量的cDNA模板、引物、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）、緩沖液和Taq DNA聚合酶等反應(yīng)成分。然后，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增過(guò)程通常包括變性、退火和延伸三個(gè)步驟，通過(guò)控制溫度和時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。

檢測(cè)：在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度。隨著產(chǎn)物的積累，熒光信號(hào)的強(qiáng)度等比加強(qiáng)。每經(jīng)過(guò)一次循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，即可得到一個(gè)熒光擴(kuò)增曲線。根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化即可監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶DNA的定量分析。

需要注意的是，熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)步驟可能因?qū)嶒?yàn)?zāi)康暮退迷噭┑牟煌兴町悺Ｒ虼耍诰唧w實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)參考試劑說(shuō)明書(shū)和實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行操作。

綜上所述，熒光定量PCR是一種高靈敏度、高特異性的定量分析方法，在生物醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。