干貨分享：熒光定量PCR原理和操作步驟

熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）是一種在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。以下是熒光定量PCR的原理和步驟的詳細解釋：

一、熒光定量PCR原理

熒光定量PCR的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR過程中合成新DNA鏈的特性，結合一種熒光標記的探針或染料，通過實時監測熒光信號的增加來測量PCR反應的進行程度，從而實現對靶DNA的定量分析。

在PCR擴增時，加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針（如TaqMan熒光探針），該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號。PCR擴增時，Taq酶（具有5'-3'外切酶活性）將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

另外，熒光定量PCR所使用的熒光物質也可分為熒光染料（如SYBR熒光染料）和熒光探針兩類。在PCR反應體系中加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線確定PCR反應是否特異。

二、熒光定量PCR步驟

熒光定量PCR的實驗步驟通常包括反轉錄（如檢測RNA樣品時）、擴增和檢測三個主要階段。以下是具體步驟：

反轉錄（如適用）：對于RNA樣品，首先需要使用反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA，以便后續進行PCR擴增。

擴增：在PCR反應管中加入適量的cDNA模板、引物、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）、緩沖液和Taq DNA聚合酶等反應成分。然后，在PCR儀上進行擴增反應。擴增過程通常包括變性、退火和延伸三個步驟，通過控制溫度和時間來實現DNA的擴增。

檢測：在PCR擴增過程中，實時檢測熒光信號的強度。隨著產物的積累，熒光信號的強度等比加強。每經過一次循環，收集一次熒光信號，即可得到一個熒光擴增曲線。根據熒光強度的變化即可監測產物量的變化，從而實現對靶DNA的定量分析。

需要注意的是，熒光定量PCR的實驗步驟可能因實驗目的和所用試劑的不同而有所差異。因此，在具體實驗時，應參考試劑說明書和實驗指南進行操作。

綜上所述，熒光定量PCR是一種高靈敏度、高特異性的定量分析方法，在生物醫學研究、疾病診斷、病原體檢測等領域具有廣泛的應用價值。