細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中時(shí)如何進(jìn)行支原體污染的檢測(cè)

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體污染是一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題，它可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)支原體污染至關(guān)重要。以下是一些常用的支原體污染檢測(cè)方法：

一、觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特征

雖然支原體污染在初期可能難以通過(guò)肉眼直接觀察，但在污染較為嚴(yán)重時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度可能會(huì)減慢，培養(yǎng)基的pH值可能明顯變酸，并出現(xiàn)細(xì)胞病變。然而，由于這些病變特征與病毒感染相似，因此不能作為準(zhǔn)確診斷的依據(jù)。此外，支原體在適宜的條件下可以在培養(yǎng)基上形成特有的典型菌落，但這種方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且敏感性不夠高，通常作為其他快速檢測(cè)方法的輔助手段。

二、PCR法

PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）法是一種快速、靈敏的檢測(cè)方法，可以檢測(cè)多種支原體的污染。該方法通過(guò)特定的引物對(duì)支原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的檢測(cè)。PCR法取樣量少，既可進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)也可進(jìn)行細(xì)胞上清的檢測(cè)。它具有實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)時(shí)間短及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室均可完成。但需要注意的是，PCR法的成本較高，條件要求嚴(yán)格，有時(shí)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

三、熒光染色法

熒光染色法利用熒光染料結(jié)合到支原體DNA的特定區(qū)域（如A-T富含區(qū)域），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的檢測(cè)。被支原體污染的細(xì)胞在染色后，可以在細(xì)胞核外與細(xì)胞周?chē)^察到許多大小均一的熒光小點(diǎn)。這種方法簡(jiǎn)便、快速，且具有較高的特異性。常用的熒光染料包括Hoechst 33258和DAPI等。對(duì)于貼壁細(xì)胞可以直接進(jìn)行熒光染色觀察，也可通過(guò)轉(zhuǎn)接指示細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后染色觀察；而懸浮細(xì)胞必須接種指示細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。指示細(xì)胞需本身無(wú)支原體污染，且是支原體的敏感宿主，如Vero、NIH3T3、3T6、NRK、MDCK和A549細(xì)胞等。

四、電子顯微鏡觀察

電子顯微鏡（包括掃描電鏡和透射電鏡）或免疫電鏡下對(duì)樣本進(jìn)行觀察，可以直觀地看到支原體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。然而，這種方法對(duì)使用環(huán)境要求高，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且敏感性不高。因此，它通常作為樣品的后定性檢測(cè)手段。

五、免疫法

間接免疫熒光法和免疫印跡也是常用的支原體檢測(cè)方法。這兩種方法利用抗原-抗體反應(yīng)的原理，通過(guò)特定的抗體與支原體抗原結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的檢測(cè)。這兩種方法簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，如果應(yīng)用單克隆抗體試劑，效果會(huì)更好。此外，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）也可用于支原體的檢測(cè)，該方法基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)酶標(biāo)記的抗體與支原體抗原結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化來(lái)判斷支原體是否存在。

六、培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是支原體檢測(cè)中的常規(guī)方法，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)物的質(zhì)量控制和檢驗(yàn)。支原體由于沒(méi)有細(xì)胞壁，形態(tài)上呈多形性，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)能夠形成中心高密度、周?chē)兔芏鹊牡湫偷摹坝图搴砂啊睜罹?，?duì)于結(jié)果的判斷清晰準(zhǔn)確。但培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要數(shù)周才能得到結(jié)果。

七、其他方法

除了以上幾種方法外，還可以采用放射性核素?fù)饺敕ā⒎派渥燥@影法、基因探針?lè)ǖ确椒ㄟM(jìn)行檢測(cè)。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的方法進(jìn)行支原體污染的檢測(cè)。

在實(shí)際應(yīng)用中，為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議采用兩種或兩種以上的方法對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，還應(yīng)加強(qiáng)預(yù)防措施，降低支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。例如規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、搭配使用預(yù)防試劑以及定期檢測(cè)等。