支原體檢測pcr法有驗證方案嗎

確認所采用的支原體 PCR 檢測方法在檢測限、特異性、準確性、精密度和耐用性等方面符合預期要求，能夠準確、可靠地檢測樣本中的支原體。

驗證范圍

適用于使用 PCR 法對各類樣本（如細胞培養(yǎng)物、生物制品、臨床樣本等）中的支原體進行檢測。

驗證內容及方法

檢測限驗證

標準品制備：獲取或制備已知濃度的支原體標準菌株，如豬鼻支原體、口腔支原體、肺炎支原體等，將其進行系列稀釋，得到不同濃度的標準品溶液，濃度范圍應涵蓋預期的檢測限及以下搜狐網。

PCR 檢測：使用待驗證的 PCR 方法對各濃度標準品進行檢測，每個濃度至少進行 3 次重復實驗。

結果判斷：以能夠穩(wěn)定檢測出陽性結果的最低標準品濃度作為該方法的檢測限。歐洲藥典規(guī)定，支原體核酸擴增檢測方法如替代培養(yǎng)法，對常見 9 種支原體的檢測限需均達到 10CFU/ml。

特異性驗證

選擇對照菌株：除了支原體標準菌株外，還應選擇與支原體具有較近親緣關系的細菌，如梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌等，以及可能存在于樣本中的其他微生物作為對照。

PCR 檢測：分別以支原體標準菌株、對照菌株和陰性對照（無模板）進行 PCR 擴增。

結果判斷：只有支原體標準菌株出現(xiàn)特異性擴增條帶或熒光信號，而對照菌株和陰性對照無擴增，表明該方法具有良好的特異性。

準確性驗證

樣本選擇：選取已知感染支原體的陽性樣本和未感染支原體的陰性樣本，陽性樣本可以是經其他可靠方法確認的臨床樣本、細胞培養(yǎng)物等，陰性樣本應確保無支原體污染。

PCR 檢測：使用待驗證的 PCR 方法對陽性和陰性樣本進行檢測。

結果判斷：與已知結果進行對比，陽性樣本檢測結果應為陽性，陰性樣本檢測結果應為陰性，計算準確率。準確率 =（真陽性 + 真陰性）/（總樣本數）×100%，準確率應達到較高水平，一般要求在 95% 以上。

精密度驗證

重復性實驗：選取高、中、低不同濃度的支原體標準品或陽性樣本，在同一實驗條件下，由同一操作人員使用同一臺 PCR 儀，在短時間內進行多次重復檢測，一般重復次數不少于 10 次。

中間精密度實驗：不同操作人員在不同時間、使用不同的 PCR 儀和試劑批次對上述樣本進行檢測。

結果判斷：計算重復性和中間精密度實驗的標準差和變異系數，變異系數應在可接受范圍內，一般要求小于 15%。

耐用性驗證

改變反應條件：分別對 PCR 反應的退火溫度、引物濃度、模板量、循環(huán)次數等關鍵參數進行適當的改變，如在標準反應條件的基礎上，將退火溫度上下浮動 5℃，引物濃度增加或減少 1 倍等。

PCR 檢測：使用改變條件后的反應體系對支原體標準品和陽性樣本進行檢測。

結果判斷：觀察檢測結果的變化情況，若在一定范圍內改變反應條件后，仍能準確檢測出支原體，且檢測限、特異性、準確性等指標無明顯變化，則表明該方法具有較好的耐用性。

驗證結果記錄與報告

詳細記錄每次實驗的條件、樣本信息、檢測結果等數據。

對驗證結果進行統(tǒng)計分析和總結，撰寫驗證報告，包括驗證目的、方法、結果、結論以及建議等內容。如果驗證結果符合要求，則該 PCR 方法可用于常規(guī)支原體檢測；如果不符合要求，則需要對方法進行優(yōu)化和改進，重新進行驗證。