胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)指南之胚胎干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

常見的胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法中的飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。

(一)飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)

飼養(yǎng)層細(xì)胞是指與胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)能促進(jìn)其增殖和抑制其自主分化的細(xì)胞。

1. 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的培養(yǎng)

選擇商品化的MEF或自行元代分離培養(yǎng)。

（3）培養(yǎng)結(jié)果

在培養(yǎng)MEF初始的1～2代時(shí),雜細(xì)胞（非成纖維細(xì)胞的其他組織細(xì)胞）較多,細(xì)胞形態(tài)多樣；在第三代開始時(shí),雜細(xì)胞逐漸減少。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為梭狀；但連成片時(shí),由于受雜細(xì)胞的影響,形態(tài)不夠典型。

2.STO細(xì)胞的培養(yǎng)

STO 細(xì)胞是已建系的細(xì)胞,故可按一般已建系的細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)。

3.討論

使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)作為飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞是一種比較早和常用的方法。

MEF能產(chǎn)生抑制胚胎干細(xì)胞自主分化和促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的因子,故它能有效地促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖并維持其未分化二倍體狀態(tài)和全能性。但使用MEF也有缺點(diǎn)

①M(fèi)EF生命期有限,不能在體外長(zhǎng)期傳代。在體外傳代時(shí)間太長(zhǎng)，其產(chǎn)生促增殖因子和抑制分化因子的能力會(huì)減弱甚至喪失。**使用第3～5代MEF, 因?yàn)榈?～5代的MEF生長(zhǎng)和各種因子分泌都旺盛,雜細(xì)胞也較少。這就需要經(jīng)常準(zhǔn)備12.5～14.5d懷孕小鼠制備MEF。

②MEF不具有耐藥性,不能作為轉(zhuǎn)染外源性基因的胚胎干細(xì)胞篩選用。

③在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過程中,死亡的MEF細(xì)胞的染色體釋出可能會(huì)引起胚胎干細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持。

④不易獲得純的胚胎干細(xì)胞作為生化和分子生物學(xué)方面的分析。　

⑤種植胚胎干細(xì)胞前,如果用絲裂霉素-C處理MEF,清洗不徹底時(shí),殘余的絲裂霉素-C會(huì)影響胚胎干細(xì)胞的增殖。

STO 細(xì)胞是已建系的SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏本苷亞系（Hogan et al.1994）。它可以長(zhǎng)期進(jìn)行體外培養(yǎng)傳代和凍存。同MEF一樣,它能分泌促胚胎干細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞自主分化的因子,但效果不如MEF。作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用時(shí),常要在培養(yǎng)液中加入抑制胚胎干細(xì)胞自主分化的因子(如白血病抑制因子,LIF)。目前，已有轉(zhuǎn)染了neor抗性基因和LIF基因的STO細(xì)胞,如SNL細(xì)胞,它能分泌足夠量的LIF抑制胚胎干細(xì)胞的分化,而不需要在培養(yǎng)液中添加LIF；又因它帶有neor抗性基因,故可以用于轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞的篩選。使用STO和SNL細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞,免去了準(zhǔn)備懷孕母小鼠的繁瑣工作,但它仍有MEF ③～⑤項(xiàng)的不足。

在MEF和STO細(xì)胞(包括SNL細(xì)胞)培養(yǎng)時(shí),用DMEM加10%小牛血清作為培養(yǎng)液即可。在MEF培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)不需過高,例如不需要另外添加谷氨酰胺；如培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)過高,雜細(xì)胞容易生長(zhǎng),MEF不易純化。