胚胎干細胞體外培養指南之胚胎干細胞的分離與培養

常見的胚胎干細胞體外培養方法中的飼養層培養法。

(一)飼養層細胞的培養

飼養層細胞是指與胚胎干細胞共培養時能促進其增殖和抑制其自主分化的細胞。

1. 小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的培養

選擇商品化的MEF或自行元代分離培養。

（3）培養結果

在培養MEF初始的1～2代時,雜細胞（非成纖維細胞的其他組織細胞）較多,細胞形態多樣；在第三代開始時,雜細胞逐漸減少。小鼠胚胎成纖維細胞為梭狀；但連成片時,由于受雜細胞的影響,形態不夠典型。

2.STO細胞的培養

STO 細胞是已建系的細胞,故可按一般已建系的細胞培養方法培養。

3.討論

使用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養細胞培養胚胎干細胞是一種比較早和常用的方法。

MEF能產生抑制胚胎干細胞自主分化和促進胚胎干細胞增殖的因子,故它能有效地促進胚胎干細胞增殖并維持其未分化二倍體狀態和全能性。但使用MEF也有缺點

①MEF生命期有限,不能在體外長期傳代。在體外傳代時間太長，其產生促增殖因子和抑制分化因子的能力會減弱甚至喪失。**使用第3～5代MEF, 因為第3～5代的MEF生長和各種因子分泌都旺盛,雜細胞也較少。這就需要經常準備12.5～14.5d懷孕小鼠制備MEF。

②MEF不具有耐藥性,不能作為轉染外源性基因的胚胎干細胞篩選用。

③在胚胎干細胞培養過程中,死亡的MEF細胞的染色體釋出可能會引起胚胎干細胞的突變及影響正常核型的保持。

④不易獲得純的胚胎干細胞作為生化和分子生物學方面的分析。　

⑤種植胚胎干細胞前,如果用絲裂霉素-C處理MEF,清洗不徹底時,殘余的絲裂霉素-C會影響胚胎干細胞的增殖。

STO 細胞是已建系的SIM小鼠成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏本苷亞系（Hogan et al.1994）。它可以長期進行體外培養傳代和凍存。同MEF一樣,它能分泌促胚胎干細胞增殖及抑制細胞自主分化的因子,但效果不如MEF。作為飼養細胞使用時,常要在培養液中加入抑制胚胎干細胞自主分化的因子(如白血病抑制因子,LIF)。目前，已有轉染了neor抗性基因和LIF基因的STO細胞,如SNL細胞,它能分泌足夠量的LIF抑制胚胎干細胞的分化,而不需要在培養液中添加LIF；又因它帶有neor抗性基因,故可以用于轉基因胚胎干細胞的篩選。使用STO和SNL細胞作為飼養細胞,免去了準備懷孕母小鼠的繁瑣工作,但它仍有MEF ③～⑤項的不足。

在MEF和STO細胞(包括SNL細胞)培養時,用DMEM加10%小牛血清作為培養液即可。在MEF培養過程中，培養液的營養不需過高,例如不需要另外添加谷氨酰胺；如培養液營養過高,雜細胞容易生長,MEF不易純化。