熒光定量檢測(cè)支原體的方法

什么是熒光定量檢測(cè)支原體？熒光定量檢測(cè)支原體方法是什么？

熒光定量檢測(cè)支原體方法是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將針對(duì)支原體特異性保守序列的探針做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，簡(jiǎn)稱qPCR。

德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（均為探針法檢測(cè)）。

qPCR Kit經(jīng)典法Venor?Gem qEP

用于【細(xì)胞和生物制品】及其生產(chǎn)過(guò)程中【支原體】污染的檢測(cè)
         qPCR Kit一步法Venor?GeM qOneStep用于【細(xì)胞】培養(yǎng)中【支原體】污染的檢測(cè)

此兩類試劑盒較全球其他廠家同類產(chǎn)品，具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：

①經(jīng)典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測(cè)到107種支原體物種。操作簡(jiǎn)單，易于觀察（使用MB的試劑盒，下表中列出的支原體物種均為陽(yáng)性，其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)）。

熒光定量檢測(cè)支原體具體操作方法如下：

第1步：樣本處理

a.細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說(shuō)明：①樣品基質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測(cè)定靈敏度。

    ②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測(cè)靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理，實(shí)現(xiàn)最高靈敏度。

推薦：德國(guó)MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒

Venor? Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過(guò)廣泛驗(yàn)證。

第2步：試劑制備

a.凍干粉溶解

b. 反應(yīng)體系制備

b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備

b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備

第3步：?jiǎn)?dòng)熒光定量PCR儀

第4步：結(jié)果判別

FAM通道：檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。HEX通道：檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照熒光信號(hào)。

支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高，檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。

定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ct＜40為陽(yáng)性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。

示意圖：

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