多方面入手，讓細胞告別支原體污染

       細胞培養

　　引言

　　在疫苗生產、生物制藥，細胞免疫，Car-T，以及基礎科研過程中的細胞培養試驗，支原體污染的預防和祛除，是保證生產質量和實驗順利的重要環節。

　　往期文章，已經為大家介紹了『支原體檢測』的常規方法，其中包括熒光定量PCR方法的檢測試劑盒，以及可做方法學驗證的標準品等。

　　支原體實驗室檢測方法大PK

　　支原體常規檢測方法匯總（一）

　　支原體常規檢測方法匯總（二）

　　支原體常規檢測方法匯總（三）

　　支原體常規檢測方法匯總（四）

　　本期文章，我們將進一步、多角度的介紹『支原體祛除和預防』的常見簡便方法，希望對疫苗生產、生物制藥、細胞學研究等項目的質檢質控有所幫助。

　　關于整個細胞培養過程中支原體祛除與預防，我們將從以下三個方面展開：

　　目錄

　　一工作區域中

　　二細胞培養體系中

　　三水浴鍋、水箱等設備中

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　　一、工作區域中支原體祛除與預防

　　支原體可以說是“無處不在”，稍有不慎，環境中那些對細胞有害的支原體，很容易污染培養體系。

　　因此，應將支原體的清除與預防，日常實驗室工作區域的清潔、維護過程中。

　　除了正確穿戴實驗防護用具外（如：口罩、細胞培養室專用實驗服、鞋套等），還應定期徹底清潔工作區域：用新捷爾滅等稀釋液進行墻面、地面的噴灑和擦拭。對于桌面、實驗臺面以及擺放了儀器設備的地方，應選用針對性更強的支原體祛除預防試劑。

　　Minerva Biolabs Mycoplasma-off?就是一個不錯的選擇。該噴霧劑/濕巾中含有支原體專用殺除劑Mynox?，可在幾分鐘內迅速殺除支原體，而且對葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、牛腹瀉病毒、腺病毒、多瘤病毒、鼠諾如病毒、牛痘病毒、真菌孢子等微生物也有比較好的清除效果。

　　Mycoplasma-off?安全性高，沒有腐蝕性和致癌性成分，相比起其他消毒成分，將人體和實驗儀器設備的消毒風險降至更低。

　　即用型消毒液，可以快速簡單地保持工作區的清潔干凈。

　　二、細胞培養體系中支原體祛除與預防

　　在進行細胞培養實驗時，如果發現細胞生長緩慢、甚至大量漂浮、細胞培養液提前變黃等情況，請務必警惕，有可能就是中了支原體的招。

　　對于珍貴的細胞株，我們往往希望可以拯救一下，首先可以用PCR/qPCR方法檢測細胞是否被支原體污染。

　　如細胞株已發生污染，采取以下三種方法處理，能在盡可能短的時間，高效祛除支原體，并有一定的預防能力：

　　1、Zell Shield?支原體祛除劑（培養基用）

　　適用范圍

　　細胞已發生支原體污染，但又不愿丟棄，希望繼續培養（如已轉染或大量擴增的細胞）。

　　初始培養的原代細胞。

　　存在支原體污染高風險的細胞。

　　用法

　　1:100加入培養基。

　　當細胞存在支原體污染時，應先對細胞懸浮沖洗三次，再用含Zell Shield?培養基培養。每次傳代前都應做懸浮沖洗處理。連續傳代4次，支原體即可祛除。

　　2、Mynox? Gold支原體祛除劑（珍貴細胞保種用）

　　適用范圍

　　被支原體污染的珍貴細胞或不易獲得的生物樣本（如細胞種子）。

　　用法

　　將「**治療液」加入到4.5ml培養基（FBS需≤5%）中，培養細胞（細胞數為104~105）。

　　細胞長至80%-90%匯合時，細胞傳代。將1管「鞏固防護液」加到9.5ml培養基中，用該培養基繼續培養。

　　重復步驟2，細胞再傳代2次，支原體即完全祛除。

　　注意：每次傳代時，**都能把細胞懸浮沖洗三次，可取得更好的治療效果。

　　3、Mynox?支原體祛除劑（珍貴樣本用）

　　適用范圍

　　被支原體污染的珍貴細胞、不易獲得的生物樣本或病毒收獲液（特別是不能長期培養的樣品）。

　　用法

　　對于貼壁細胞：

　　培養皿中加入200μl Mynox?和 2.8ml培養基中（FBS≤5%），混勻。

　　再加入2ml細胞（細胞數為10^4~10^5，培養基中的FBS需≤5%）。

　　細胞培養2小時，棄上清，換用新鮮培養基培養4代即可。

　　對于懸浮細胞：

　　在離心管中加入200μl Mynox?和1.6ml胰酶（0.125 %，5 mM EDTA in PBS），混勻。

　　加入1.6ml細胞（細胞數為10^4~10^5）。

　　室溫靜置30min。

　　低速離心5min。棄上清，換用新鮮培養基培養4代即可。

　　三、水浴鍋、水箱等支原體祛除與預防

　　水浴鍋、細胞培養箱中的水槽，也容易變為各類污染滋生的溫床。保持水槽的潔凈，對細胞培養的順利進行非常重要。因此在進行清潔時，不要忘記水浴鍋、水槽等地方。

　　這里推薦大家使用支原體祛除劑（水槽用）——Water Shield?。

　　Water Shield?可持續作用4周，使水源避免受到支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子的污染。且不含醛類或疊氮化物，對細胞無毒害。

　　使用起來也十分便捷，Water Shield?與無菌水按1:200比例，直接加入水中，使用方便，使用后不產生水垢。

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