新研究研究揭示擬南芥NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CLCa的調(diào)控機(jī)制

近期，《自然-通訊》（Nature Communications）在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)**創(chuàng)新中心張鵬研究組合作完成的題為Molecular mechanism underlying regulation of Arabidopsis CLCa transporter by nucleotides and phospholipids的研究成果，揭示了核苷酸和磷脂調(diào)控?cái)M南芥硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CLCa的分子機(jī)制。

CLC（Cl- channel）蛋白普遍存在于生命體中。在哺乳動(dòng)物中，CLC蛋白分為定位在細(xì)胞質(zhì)膜上的Cl-通道以及定位在內(nèi)膜系統(tǒng)的Cl-/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）及其他植物中，CLC蛋白（CLCa-g）均定位于內(nèi)膜系統(tǒng)。其中，CLCa轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位于液泡膜，負(fù)責(zé)將胞質(zhì)中過多的NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入液泡。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，真核生物CLC的活性受到核苷酸和磷脂的調(diào)控。ATP和AMP可以差異性調(diào)控AtCLCa的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而根據(jù)光合效率調(diào)控葉肉細(xì)胞中的NO3-進(jìn)入液泡； PI(3,5)P2則可以抑制AtCLCa的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而調(diào)控ABA誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞液泡酸化和氣孔關(guān)閉。然而，關(guān)于核苷酸和磷脂調(diào)控CLC轉(zhuǎn)運(yùn)活性的分子機(jī)制并不清楚。

本研究以擬南芥CLCa蛋白為研究對(duì)象，通過異源表達(dá)并純化CLCa蛋白，將其重組為納米磷脂盤（nanodiscs）以模擬其在生物膜中的天然狀態(tài)，并分別解析了CLCa結(jié)合底物NO3-和Cl-的單顆粒冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)。CLCa形成同源二聚體，結(jié)合NO3-的CLCa結(jié)構(gòu)的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于開放狀態(tài)，而結(jié)合Cl-的CLCa結(jié)構(gòu)的孔道在膜兩側(cè)都處于關(guān)閉狀態(tài)。兩個(gè)CLCa結(jié)構(gòu)均結(jié)合了ATP和PI(4,5)P2分子。結(jié)構(gòu)和電生理分析揭示了ATP的結(jié)合會(huì)穩(wěn)定一個(gè)之前未被發(fā)現(xiàn)的N端β發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使其堵塞陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，因此抑制了CLCa的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。而AMP由于缺乏穩(wěn)定β發(fā)夾結(jié)構(gòu)所需的β/γ磷酸基團(tuán)而失去抑制能力，因而可以與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CLCa從而釋放其轉(zhuǎn)運(yùn)活性。該工作很好地解釋了CLCa如何通過感知不同光合效率下葉肉細(xì)胞的能量狀態(tài)（ATP/AMP比例）來調(diào)節(jié)NO3-向液泡中的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而維持碳氮平衡（圖1a）。PI(4,5)P2或PI(3,5)P2分子可以結(jié)合在CLCa的二聚體交界面上，其肌醇頭部占據(jù)了附近的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)通道的細(xì)胞質(zhì)側(cè)出口，可能因此抑制了CLCa的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。這有助于理解生理狀況下PI(3,5)P2如何通過抑制CLCa的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞液泡酸化和氣孔關(guān)閉（圖1b）。序列分析顯示核苷酸和磷脂的調(diào)控機(jī)制在植物液泡膜定位的CLC蛋白中可能都是保守的。

本研究揭示了核苷酸和磷脂在特定生理場(chǎng)景下調(diào)控?cái)M南芥CLCa活性的分子機(jī)制，為未來改造植物CLC蛋白進(jìn)而調(diào)控碳氮平衡以及提高水分利用效率奠定了重要的分子基礎(chǔ)。此外，研究提示類似的機(jī)制可能也存在于其他真核生物CLC蛋白中。

冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集和樣品分析得到了復(fù)旦大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院生物與化學(xué)交叉研究中心和分子植物**創(chuàng)新中心公共技術(shù)服務(wù)中心的幫助。研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金和中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)的支持。該研究由分子植物**中心和復(fù)旦大學(xué)合作完成。

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