新研究！雙CRISPR-Cas3系統誘導多外顯子跳躍，有望治療大多數DMD患者

日本京都大學的 Akitsu Hotta 團隊在 Cell Press 旗下期刊 Stem Cell Reports 上發表了題為：Dual CRISPR-Cas3 system for inducing multi-exon skipping in DMD patient-derived iPSCs 的研究論文。

該研究開發了一種雙重CRISPR-Cas3系統進行多外顯子跳躍（MES），能夠誘導杜氏肌營養不良（DMD）患者來源的誘導多能干細胞的肌營養不良蛋白（Dystrophin）基因外顯子45-55區域的大片段缺失（~340kb），產生截短但仍有功能的肌營養不良蛋白，該方法能夠覆蓋60%以上的DMD患者。此外，該研究未發現明顯的脫靶缺失。

這項研究表明，雙CRISPR-Cas3系統是一種很有前景的工具，可通過多外顯子跳躍（MES）誘導大片段基因組缺失，啟發了治療DMD和其他需要大量刪除基因片段的遺傳疾病的新方法。

由于影響肌營養不良蛋白基因的突變模式存在顯著差異，因此，跳過或刪除一小部分片段只適用于有限的DMD患者。例如，最常見的外顯子51、53和45的單外顯子跳躍分別適用于13%、8%和8%的DMD患者。

多外顯子跳躍（MES）廣泛適用于多種DMD突變模式。通過靶向肌營養不良蛋白基因的突變熱點，研究人員估計外顯子45-55的MES，能使60%以上的DMD患者受益。然而，很少有技術可以誘導如此大片段的基因刪除，以覆蓋分布在幾百個堿基上的目標外顯子。

為了克服這一障礙，研究團隊使用CRISPR-Cas3在各種DMD突變模式的肌營養不良蛋白45-55外顯子區域誘導了多達340kb的缺失。因為使用單個CRISPR RNA基本難以刪除超過100bp，所以研團隊在目標基因組區域內使用了一對CRISPR RNA。

研究團隊指出了這種雙CRISPR RNA系統的潛在局限性。首先，刪除模式存在變異，其精確起點和終點無法完全控制。當需要大量但精確刪除時，這可能是一個缺點。其次，該研究沒有證明肌營養不良蛋白功能的恢復情況。第三，還需要開發其他方法來提高Cas3系統的整體基因組編輯效率。

論文通訊作者 Akitsu Hotta 表示，雙CRISPR-Cas3是一種很有前途的工具，可以通過多外顯子跳躍誘導來實現基因刪減。一旦能夠將雙CRISPR-Cas3系統安全有效地遞送到體內骨骼肌組織中，就有望應用于未來的基因治療。此外，誘導數百個DNA堿基缺失技術本身在基礎研究中也具有廣泛的適用性。希望這項研究能夠啟發治療DMD和其他需要大量刪除基因片段的遺傳疾病的新方法。

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