新研究開發(fā)多能干細(xì)胞(iPSC)衍生的腎類器官

研究人員已經(jīng)產(chǎn)生了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)衍生的腎類器官來模擬由COL4A5基因突變引起的Alport綜合征，并證明了化學(xué)伴侶蛋白的效用，以挽救由突變引起的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和膠原蛋白錯(cuò)誤組裝。這項(xiàng)研究發(fā)表在《Communications Biology》雜志上。

據(jù)估計(jì)，在美國(guó)和歐洲，阿爾波特綜合癥(AS)的發(fā)病率分別為5000分之一到5萬分之一，而在日本，估計(jì)約有1200人患有這種疾病。它是遺傳性腎小球腎炎的第二常見形式，由幾個(gè)基因(COL4A3、COL4A4或COL4A5)突變引起，這些基因在腎臟腎小球基底膜(GBM)中形成一種特殊類型的膠原(即α3α4α5[IV]膠原)，并在生命早期表現(xiàn)為終末期腎病(ESRD)。

不幸的是，由于缺乏體外模型來推斷和糾正AS患者膠原蛋白組裝缺陷，目前尚無根治性治療方法，其致病機(jī)制也未完全了解。

由Kenji Osafune教授(細(xì)胞生長(zhǎng)與分化系)領(lǐng)導(dǎo)的中國(guó)CiRA和大正制藥有限公司的研究小組從兩名x連鎖AS患者身上制造了iPSCs，以生產(chǎn)腎臟類器官。具體來說，神戶大學(xué)的一組醫(yī)生收集了一名由COL4A5基因G545D錯(cuò)義突變引起的輕度AS患者和另一名由T552Sfs*6移碼突變引起的嚴(yán)重AS患者的血液樣本，該突變產(chǎn)生了用于iPSC生成的截?cái)嗟哪z原α5(IV)蛋白。

研究小組還利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)制作了一個(gè)AS突變糾正的iPSC系，以逆轉(zhuǎn)輕度AS患者的COL4A5 G545D錯(cuò)義突變。基于先前報(bào)道的經(jīng)過一些修改的分化方案，他們通過患者特異性和健康對(duì)照iPSCs衍生的腎細(xì)胞祖細(xì)胞產(chǎn)生了腎類器官。

值得注意的是，研究人員觀察到，機(jī)械攪拌的腎類器官的自由漂浮培養(yǎng)有助于促進(jìn)它們的成熟，這是本研究的一個(gè)關(guān)鍵特征，因?yàn)樵谀I臟發(fā)育過程中，GBM膠原組成從α1α1α2(IV)轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>α3α4α5(IV)異源三聚體。

因此，研究人員能夠產(chǎn)生表達(dá)α5(IV)膠原的腎類器官，并在健康和突變糾正的輕度As iPSCs衍生的腎類器官的GBM樣結(jié)構(gòu)中觀察到膠原α3α4α5(IV)。然而，反映臨床表型的是，輕度和重度AS iPSCs衍生的腎類器官表達(dá)α2(IV)而不表達(dá)α5(IV)膠原。

進(jìn)一步的透射電子顯微鏡分析顯示，輕度和重度AS腎類器官均未顯示出先前在成年AS模型(Col4a5 G5x突變體)小鼠中觀察到的一些特征性GBM超微結(jié)構(gòu)異常，這表明這種超微結(jié)構(gòu)變化可能需要進(jìn)一步成熟才能完全表現(xiàn)出來。

盡管如此，由于腎類器官已經(jīng)達(dá)到了一個(gè)發(fā)育階段，可以重現(xiàn)IV型膠原的異構(gòu)體轉(zhuǎn)換，研究人員可以區(qū)分來自輕度和重度AS病例的患者特異性iPSCs產(chǎn)生的腎類器官之間的差異。具體來說，COL4A5表達(dá)僅在嚴(yán)重AS腎類器官中降低，類似于COL4A5突變小鼠中觀察到的下調(diào)，可能是由疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的無義介導(dǎo)的衰變(NMD)造成的。

然而，引起輕度AS的G545D突變不太可能引發(fā)NMD，因此，COL4A5的表達(dá)在由輕度AS iPSCs產(chǎn)生的腎類器官中不受影響。此外，α3(IV)膠原蛋白在輕度AS腎臟類器官中檢測(cè)到，而在嚴(yán)重AS腎臟類器官中，盡管在RNA水平上表達(dá)正常，但未見α3(IV)膠原蛋白。以往的臨床研究表明，在表現(xiàn)為輕度癥狀的AS患者中可檢測(cè)到α3(IV)或α5(IV)蛋白，這說明腎類器官可以準(zhǔn)確地模擬輕、重度AS病理的各個(gè)方面。

膠原異三聚體通常聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，并由高爾基體分泌到細(xì)胞外空間。由蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起的組裝缺陷會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并引發(fā)未組裝或錯(cuò)誤組裝的膠原的自噬降解。

由于先前的一項(xiàng)研究已經(jīng)證明了化學(xué)伴侶通過減輕蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊來減少由COL4A2突變引起的患者原發(fā)性真皮成纖維細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)膠原積累和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的潛力，研究人員研究了類似的方法是否可以逆轉(zhuǎn)由AS COL4A5突變引起的腎類器官中觀察到的一些異常。

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，他們用幾種低分子量化學(xué)伴侶，4-苯基丁酸(4-PBA)，三甲胺n -氧化物(TMAO)和甘露醇處理輕度AS腎類器官，并觀察到α5(IV)膠原蛋白在4-PBA處理的突變GBM樣結(jié)構(gòu)中，從而突出其作為AS治療的可行治療策略的潛力。

總之，這項(xiàng)合作努力成功地產(chǎn)生了一個(gè)體外疾病模型，以再現(xiàn)AS病理的幾個(gè)關(guān)鍵方面。有了這個(gè)新的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，研究人員現(xiàn)在可以闡明這種使人衰弱的疾病的詳細(xì)致病機(jī)制，并預(yù)測(cè)對(duì)新療法的治療效果。

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