支原體檢測(cè)方法介紹

支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題，據(jù)報(bào)道，大約5-15%的細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染。支原體的高污染率可能是由于其各種來(lái)源，如受污染的培養(yǎng)基和血清、原始組織或細(xì)胞的污染以及不當(dāng)操作引起的污染。盡管自然界中存在的支原體有120 多種，但污染細(xì)胞的支原體主要有5種，分別為牛源的萊氏無(wú)膽甾原體和精氨酸支原體，人源的口腔支原體和發(fā)酵支原體，豬源的豬鼻支原體，這5 種支原體占所有支原體污染的95%以上。

我們且來(lái)看看每種不同的檢測(cè)方法：

1.培養(yǎng)法

檢查支原體采用支原體液體培養(yǎng)基和支原體半流體培養(yǎng)基。半流體培養(yǎng)基在使用前應(yīng)煮沸10-15min，冷卻至56℃，然后加入滅能小牛血清(培養(yǎng)基：血清8:2)，并可酌情加入適量青霉素，充分搖勻。液體培養(yǎng)基無(wú)需煮沸，其他同樣。

2. 指示細(xì)胞培養(yǎng)法(DNA染色法)

將供試品接種于指示細(xì)胞(無(wú)污染的Vero細(xì)胞或經(jīng)國(guó)家藥品鑒定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞)中培養(yǎng)，用特意熒光染料染色。如支原體污染供試品，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)附在細(xì)胞表面的支原體DNA著色。

3.PCR 方法

傳統(tǒng)的支原體檢測(cè)方法通常需要較長(zhǎng)時(shí)間，如培養(yǎng)法至少需要28天，已經(jīng)無(wú)法滿足如CAR-T等藥物放行的時(shí)間要求，亟需新的檢測(cè)方法以供選擇。核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)由于其快速、特異性強(qiáng)，在支原體檢測(cè)中越來(lái)越受到人們的青睞，但首先必須達(dá)到或超過(guò)藥典方法的靈敏度。使用NAT快速檢測(cè)支原體已有很多技術(shù)和文獻(xiàn)的發(fā)表，我們以《A Rapid and Sensitive Nucleic Acid Amplification Technique for Mycoplasma Screening of Cell Therapy Products》為例

該方案涉及從細(xì)胞治療產(chǎn)品樣品中提取DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增支原體核酸，并通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行可視化分析。通過(guò)添加規(guī)定數(shù)量的支原體基因組DNA(gDNA)，避免使用活支原體來(lái)證明檢測(cè)敏感性，該DNA通過(guò)經(jīng)驗(yàn)推導(dǎo)的基因組拷貝與CFU(GC/CFU)比值轉(zhuǎn)換為CFU/mL值。為了滿足監(jiān)管要求，新的檢測(cè)方法必須經(jīng)過(guò)內(nèi)部認(rèn)證，以滿足或超過(guò)藥典方法的靈敏度，對(duì)于支原體屬的靈敏度為10 CFU/mL。

北京締一生物科技有限公司國(guó)內(nèi)總代理的德國(guó)MB產(chǎn)品，10CFU支原體檢測(cè)限標(biāo)準(zhǔn)品10 CFU Mycoplasma Sensitivity Standards

10CFU支原體檢測(cè)限標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)品特點(diǎn)

（1）來(lái)自英國(guó)菌種保藏中心NCTC，是滅活支原體；

（2）傳代次數(shù)少，支原體無(wú)變異；

（3）產(chǎn)品為凍干粉，保證其穩(wěn)定性；

（4）分析證書（COA）提供該批次GU：CFU比值（基因組單位/菌落形成單位比值）；

（5）支原體已滅活，保障細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室安全。