各國藥典對支原體檢測方法學驗證

各國藥典對支原體核酸擴增檢測方法（簡稱NAT法）的驗證要求略有出入，但均要求對最低檢出限、特異性和耐用性進行驗證。在檢測方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進行支原體檢測。

如使用商品化試劑盒，則除了需要試劑盒生產商提供完整的方法學驗證數據外，還需要使用者驗證試劑盒對其樣本的適用性，以及試劑盒表現出預期的性能（例如檢測限、耐用性、是否存在與細菌的交叉反應）。這些必須由使用者自己來證明。

在最低檢出限驗證中，歐洲藥典（簡稱EP）規定了污染細胞的常見9種支原體，要求NAT如替代培養法，對這9種支原體的檢測限需均達到10CFU/ml。其中如果生產中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關節液支原體（M.synoviae）。

日本藥典（簡稱JP）中的驗證要求與EP基本一致，但在最低檢出限驗證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗證。

最終待驗證的支原體物種的選擇，在依據藥典基礎上，還需根據支原體污染風險大小而定。污染風險的影響因素有支原體寄生的宿主細胞的特異性、原材料的來源、產品的應用領域等。

關于檢測限和耐用性的檢測次數，有如下公式可參考：

檢測次數= 支原體物種數 × 3 輪獨立檢測 × 8個復孔/每個物種/每輪

以歐洲藥典規定的9種支原體為例，實際所需檢測次數為9 × 3 × 8 = 216 次檢測。

加上陰性對照、陽性對照、無模板對照以及特異性驗證，預計規格為250次/盒的試劑盒較為適合。

在NAT法的特異性驗證方面，歐洲藥典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關系，應優先選擇進行驗證。