新研究翻譯調控型T-box核糖開關折疊與識別tRNA耦聯的結構與動態機制

T-box核糖開關是一類位于革蘭氏陽性細菌mRNA的 5'非翻譯區的結構元件，其長度通常在300核苷酸以下，可分為適配體結構域和表達平臺結構域。T-box核糖開關通過其適配體結構域識別和結合特定的tRNA并感知其3'末端的氨酰化狀態，引發下游RNA元件構象狀態的轉變進而在翻譯水平或轉錄水平調控下游基因的表達。與其它核糖開關一般通過識別小分子代謝物或離子調控基因表達的機制不同，T-box基因表達調控的功能主要是通過兩個高度結構化的RNA（T-box核糖開關和tRNA）之間的相互作用實現的。近年來多種T-box核糖開關與tRNA復合物的三維結構已被解析，但是分子內的和分子間的RNA-RNA相互作用是如何促進T-box核糖開關的折疊和結構轉變進而形成特定構象狀態以發揮生理功能的機制仍不清楚。

2023年11月15日，中國科學院生物物理研究所方顯楊研究組與清華大學生命科學學院陳春來研究組合作，在《Nature Communications》在線發表了題為"Structural and dynamic mechanisms for coupled folding and tRNA recognition of a translational T-box riboswitch"的研究論文。在該項研究中，研究人員通過整合應用小角X射線散射（SAXS）技術、單分子熒光共振能量轉移（smFRET）技術以及分子動力學模擬，探究了來自皮疽諾卡氏菌（Nocardia farcinica）的ileS T-box核糖開關適配體結構域(包含stem I, stem II和stem IIA/B莖環元件)在溶液中的折疊與構象動態，構建了由鎂離子及tRNA介導的T-box核糖開關適配體結構域的折疊自由能面，為深入理解RNA-RNA相互作用對RNA折疊與識別的重要影響以及發展和理性設計靶向RNA的新型抗生素藥物提供了理論依據。

在該項研究中，為實現對T-box核糖開關適配體結構域的高密度熒光探針標記(dense labeling)進而利用smFRET技術研究其構象動態，方顯楊研究組發展了基于非天然堿基系統（NaM-TPT3）的長鏈RNA位點特異性熒光探針正交標記技術，通過重疊延伸PCR及體外轉錄向RNA的特定位點引入化學修飾的非天然堿基，通過點擊化學以及NHS酯基與氨基的化學反應將熒光探針與非天然堿基相耦聯，從而實現對RNA的位點特異性標記。該方法突破了傳統RNA位點特異性標記技術(如化學合成等)在標記長度、標記效率及對結構的干擾等方面的局限性，將極大的推動和拓展smFRET技術在研究長鏈RNA構象動態以及解析三維溶液結構模型中的應用。

利用基于非天然堿基系統的位點特異性正交熒光標記策略，研究者在T-box核糖開關適配體結構域上選擇了七對標記位點，構建了一個密集的標記網絡，得以全面的探究tRNA及鎂離子誘導的T-box核糖開關適配體的構象動態。研究發現，鎂離子可以穩定stem IIA/B假結結構，使其與stem II結構域共軸堆積，進而誘導stem I與stem II結構域的預對接，使T-box折疊為可以結合tRNA的活性構象，而tRNA的結合則進一步誘導了stem I與stem II結構域的對接。此外，研究者也利用SAXS技術結合分子動力學模擬建立了T-box核糖開關不同長度的轉錄中間產物在不同鎂離子條件下的溶液結構模型，并結合突變實驗進一步證實了stem IIA/B假結結構以及S-turn結構基序在T-box識別tRNA過程中的重要作用。

綜合上述實驗結果，研究者們提出了鎂離子及tRNA介導的T-box核糖開關適配體的共轉錄折疊模型，揭示了在轉錄過程中T-box核糖開關各個結構元件相互協同調控促進其折疊，最終保證其能高效、快速識別tRNA的分子機制。總的來說，該項工作揭示了鎂離子以及分子內或分子間的RNA-RNA相互作用之間的微妙平衡在調控T-box核糖開關折疊以及功能中的作用。

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