細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞支原體污染檢測(cè)方法

細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞支原體污染的檢測(cè)方法主要包括以下幾種：

相差顯微鏡檢測(cè)：將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，24小時(shí)后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。

熒光染色法：用熒光染料使支原體DNA著色，置熒光顯微鏡下觀察，可見散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)為支原體污染。

電鏡檢測(cè)：用掃描電鏡或透射電鏡觀察支原體。

DNA分子雜交檢測(cè)或支原體培養(yǎng)等方法。

試劑盒檢測(cè)法：目前已有專門做支原體檢測(cè)的試劑盒，可以用細(xì)胞滴片進(jìn)行檢測(cè)。

德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（均為探針法檢測(cè)），依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別， 分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。   

此兩類試劑盒較全球其他廠家同類產(chǎn)品，具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：

①經(jīng)典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測(cè)到107種支原體物種。操作簡(jiǎn)單，易于觀察（使用MB的試劑盒，下表中列出的支原體物種均為陽性，其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性，無交叉反應(yīng)）。

③高靈敏度，MB公司的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒經(jīng)典法最低檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。

MB公司的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒一步法最低檢測(cè)限≥50個(gè)基因組/反應(yīng)。

④MB公司有相應(yīng)配套的10CFU/100CFU的敏感度測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)品，便于方法學(xué)驗(yàn)證。

⑤MB公司有相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗(yàn)證。

⑥MB公司有相應(yīng)配套的支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測(cè)。

觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)特征：支原體污染比較嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)生長(zhǎng)減慢，有的培養(yǎng)基pH明顯變酸，并出現(xiàn)細(xì)胞病變，以此可依次對(duì)支原體污染進(jìn)行檢測(cè)。

分離培養(yǎng)法：大多數(shù)支原體可出現(xiàn)特有的典型菌落。

DNA結(jié)合熒光素染色法：利用熒光染劑（bisbenzimide，Hoechst 33258）偵測(cè)支原體污染。熒光染料會(huì)結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因?yàn)橹гwDNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而偵測(cè)。

電子顯微鏡和免疫電子顯微鏡法：電子顯微鏡或者免疫電鏡下對(duì)樣本進(jìn)行觀察，此法較準(zhǔn)確，但受條件限制，時(shí)間長(zhǎng)，敏感性不高。

各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)具體情況，選擇不同的方法，或幾種方法聯(lián)合使用，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。