在PCR實驗中DNA聚合酶作用和常用的DNA聚合酶DNA聚合酶作用和常用的DNA聚合酶 二維碼
發表時間：2024-01-18 16:32 PCR相關實驗在現代生命科學研究中發揮著重要作用。在PCR相關實驗中，會用到各種酶試劑，這些試劑關系到實驗的成功與否。其中，DNA聚合酶在DNA和RNA的操控、合成和分析中都發揮著難以替代的作用，成為科學家們揭示分子生物學奧秘的有力的工具。本期內容，盤點PCR實驗中常用的DNA聚合酶試劑。 DNA聚合在PCR實驗中的作用 DNA聚合酶（DNA Polymerase）參與DNA分子的合成過程。它在細胞中的主要功能是在DNA復制中負責合成新的DNA鏈。 DNA聚合酶使用DNA模板上的信息，根據堿基互補配對原則（A-T，C-G）配對。），從5'→3'，即從新鏈的5'端到3'端進行，在新鏈上加入互補的核苷酸。DNA聚合酶只能在已存在的DNA鏈上進行合成，因此需要一個起始點，稱為引物（primer），來提供3'端的OH基團，該過程一直持續到整個DNA鏈被復制完成。 除了PCR實驗中，在生物體的細胞中，也有DNA聚合酶的參與，例如，幫助DNA損傷修復和維護基因組的完整性。
PCR實驗中常見的DNA聚合酶 DNA聚合酶是一類酶的總稱，有多種種類，每種都具有不同的特性和應用。 Taq DNA聚合酶 來源 從耐熱細菌Thermus aquaticus中分離得到。 特點 耐熱性：Taq DNA聚合酶的適宜工作溫度通常在70°C至75°C之間。這使得Taq DNA聚合酶非常適合PCR反應，因為PCR需要在每個循環中通過高溫步驟來分離DNA鏈。 5'→3'聚合酶活性 Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性，即它能夠在DNA鏈的5'端到3'端方向上合成新的DNA鏈。 沒有3'→5'外切酶活性 與一些其他DNA聚合酶不同，Taq DNA聚合酶不具備3'→5'外切酶活性，這意味著它缺乏校正能力，容易引入突變。因此，在PCR反應中，Taq DNA聚合酶的錯誤率相對較高。 DNA模板依賴性：Taq DNA聚合酶對于DNA模板的依賴性較強，需要引物（primer）提供3'端的OH基團，作為新DNA鏈的起始點。
Pfu DNA聚合酶 來源 從嗜熱古細菌Pyrococcus furiosus中分離得到。 特點 高度的3'→5'外切酶活性：Pfu DNA聚合酶表現出高度的外切酶活性，使得其能夠進行校對，糾正PCR反應中可能發生的錯誤。這有助于提高擴增產物的準確性。 高保真度：由于其強大的外切酶活性，Pfu DNA聚合酶在PCR反應中具有更低的錯誤率，提供高度保真的DNA合成。 溫度適應性：Pfu DNA聚合酶在較高的溫度范圍內（通常在72°C至75°C）表現出較高的活性，適用于PCR反應的高溫步驟。 缺乏5'→3'外切酶活性：與一些其他聚合酶不同，Pfu DNA聚合酶通常不具備5'→3'外切酶活性，因此不會引入額外的5'端修飾。
大腸桿菌DNA聚合酶 來源 從大腸桿菌（Escherichia coli）中分離得到。 特點 多功能性：大腸桿菌中有三種不同類型的 DNA 聚合酶，即 DNA 聚合酶 Ⅰ、DNA 聚合酶 Ⅱ 和 DNA 聚合酶 Ⅲ，它們分別簡稱為 PolⅠ、PolⅡ 和 PolⅢ。PolⅠ 和 PolⅡ 的主要功能是參與 DNA 的修復過程，而 PolⅢ 的功能看來是同 DNA 的復制有關。 基因克隆：大腸桿菌DNA聚合酶在基因克隆中廣泛應用，用于合成DNA片段、連接DNA末端，是DNA構建的關鍵工具之一。 PCR輔助：在PCR實驗中，某些大腸桿菌DNA聚合酶的外切酶活性，比如：Klenow片段，可以用于擴增產物末端的修飾，例如A添加（A-tailing）。 低錯誤率：大腸桿菌DNA聚合酶通常具有相對較低的錯誤率，這在一些實驗中是需要考慮的因素。然而，與一些高保真度的DNA聚合酶相比，其準確性可能較低。
T4 DNA聚合酶 來源 來自噬菌體T4的DNA聚合酶，屬于T4 DNA復制和修復機制中的關鍵酶之一。 特點 5'→3'聚合酶活性：T4 DNA聚合酶主要表現為5'→3'聚合酶活性，即在合成新的DNA鏈時，從DNA鏈的5'端到3'端方向進行。 3'→5'外切酶活性：T4 DNA聚合酶還具有3'→5'外切酶活性，能夠修剪單鏈DNA的3'末端。在反向切除DNA片段時非常有用，例如在DNA修復和重組過程中。 缺乏核酸內切酶活性：與一些其他T4 DNA復制酶不同，T4 DNA聚合酶通常不具有核酸內切酶活性，因此不會切割雙鏈DNA。 依賴于引物：T4 DNA聚合酶在DNA合成時需要引物提供3'端的OH基團，因此通常在反應中需要引物的引導。 DNA末端修飾：T4 DNA聚合酶可用于在DNA末端進行修飾，例如通過添加dA（腺嘌呤）或dG（鳥嘌呤）來形成A懸垂末端或G懸垂末端。
好物推薦 PCR實驗 德國Minerva Biolabs公司生產的 Taq DNA聚合酶是一種高效的5‘→3’聚合酶，沒有3‘→5’外切核酸酶活性。在72℃和pH9的條件下，MB Taq DNA聚合酶達到其最高水平的活性，能夠在30秒內擴增1 kb DNA。 Taq的活性在室溫時被阻斷，例如在準備樣品時。當溫度高于70℃時，Taq聚合酶的抑制被完全逆轉。在94℃2分鐘后聚合酶達到完全活化。MBTaq DNA聚合酶帶有10x緩沖液，能獲得更大產率和靈敏度，這應符合大多數標準應用。 MB Taq 熱啟動DNA聚合酶推薦使用/范圍： 常規和多重PCR；實時PCR；T/A克隆；生物素/地高辛或放射性核苷酸進行DNA標記；雙鏈或單鏈標準DNA測序
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