開發(fā)基于RNA核酶的新型基因編輯工具

基因承載著遺傳信息，定義了生命的多樣性和復(fù)雜性。基因編輯是理解和改造生命的關(guān)鍵技術(shù)，在生物學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。歷代基因編輯工具，如巨核酸酶、ZFNs、TALENs均以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)，識別和切割DNA，編輯位點的重編程較為困難。目前被廣泛使用的CRISPR-Cas工具，是RNA引導(dǎo)的蛋白核酸酶，通過引導(dǎo)RNA的間隔序列來識別DNA，具有很好的編輯位點重編程能力，但依然存在著PAM序列限制、分子量大、蛋白免疫原性等多種問題。2024年2月1日，生命中心、清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰(Jun-Jie Gogo Liu)課題組在Science雜志在線發(fā)表了題為Hydrolytic endonucleolytic ribozyme (HYER) is programmable for sequence-specific DNA cleavage的研究論文，報道了一種催化性RNA(核酶)—HYER(水解型內(nèi)切核酶)。HYER可序列特異地切割RNA和DNA底物，并對哺乳動物細胞基因組產(chǎn)生位點特異的編輯。無需蛋白核酸酶的參與，HYER的底物識別和切割均由RNA分子實現(xiàn)，有望成為繼CRISPR之后，新一代的基因編輯底盤工具。

HYER源自細菌逆轉(zhuǎn)座子(第二類內(nèi)含子，GII intron )，一種可在宿主基因組上“拷貝和粘貼”(逆轉(zhuǎn)座)的可移動元件。該元件通常編碼一個兼具核酸酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白質(zhì)，以及一個RNA分子，通過形成蛋白核酸復(fù)合物(RNP)來執(zhí)行在宿主基因組中的逆轉(zhuǎn)座擴增。有趣的是，通過廣泛的生物信息學(xué)篩選，劉俊杰(Jun-Jie Gogo Liu)課題組發(fā)現(xiàn)了許多不編碼蛋白的、緊湊的二類C型內(nèi)含子(ORF-less GII-C intron)在細菌基因組中存在多拷貝的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象暗示，這些內(nèi)含子編碼的**組份，RNA分子，可能具有不依賴蛋白的擴增位點識別和切割能力，來實現(xiàn)內(nèi)含子在宿主基因組內(nèi)的拷貝擴增。  

生化實驗表明，這些長度約600 nt的RNA分子在廣譜的離子濃度和溫度范圍內(nèi)，具有顯著的RNA和DNA水解切割活性。因此，研究人員將這些RNA分子命名為水解型內(nèi)切核酶(Hydrolytic Endonucleolytic Ribozymes, HYERs)，這是科學(xué)界**報道具有DNA水解切割能力的核酶(Ribozyme)。值得注意的是，HYER1和HYER2表現(xiàn)出了與緊湊型的CRISPR-Cas12e (CasX) 和Cas12l (Cas π)相當?shù)?/span>DNA體外切割效率。為檢驗HYER在細胞內(nèi)的DNA切割能力，研究人員在大腸桿菌中構(gòu)建了ccdB毒蛋白報告系統(tǒng)，證明HYER1和HYER2可以對帶有ccdB毒基因的質(zhì)粒進行靶向切割。在HEK293T細胞內(nèi)，研究人員構(gòu)建了移碼Puromycin抗性基因(puro*)報告系統(tǒng)。結(jié)果表明，HYER1可對puro*產(chǎn)生移碼編輯，賦予細胞Puromycin抗性。在抗性篩選富集后的細胞里，三個靶位點中最高的編輯效率為9.18%。這表明，HYER可以在真核細胞基因組中引入雙鏈斷裂并產(chǎn)生編輯。然而，在未經(jīng)Puromycin篩選富集的細胞中，編輯效率僅為0.09%到0.2%，表明HYER的真核基因編輯能力還有很大的進步和優(yōu)化空間。

研究人員利用冷凍電鏡獲得了HYER1的高分辨三維結(jié)構(gòu)(3.0 ?)，發(fā)現(xiàn)HYER1以同源二聚體的形式存在，并揭示HYER1水解切割DNA的機理。HYER1通過一段暴露的單鏈RNA (6 nt)區(qū)域，TRS (Target Recognition Site)，識別并招募DNA底物，將DNA捕獲在結(jié)構(gòu)域V所形成的催化核心中，通過經(jīng)典的雙鎂離子機制催化DNA水解。  

基于HYER的三維結(jié)構(gòu)，研究人員進行了多種理性設(shè)計，證明HYER具有良好的可編程性，可根據(jù)底物序列，靈活設(shè)計TRS的序列和長度；在TRS臨近區(qū)域插入14 nt 的底物招募序列(Recruiting Sequence, RS)，可明顯提高HYER1的底物識別特異性和切割效率；對回文序列和TRS進行改造， HYER1則可形成帶有兩個不同TRS的異源二聚體，靶向雙鏈DNA底物的不同區(qū)域，產(chǎn)生了具有5’突出、3’突出或平末端的定制化切割產(chǎn)物。  

有趣的是，受“RNA世界”假說的啟發(fā)，研究人員提出了第二類內(nèi)含子中的“RNA的催化功能逐漸被蛋白質(zhì)取代”的分子進化歷程：在進化過程中，第二類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)域IV逐漸擴大，并產(chǎn)生了可編碼短肽的開放閱讀框(ORF)，而這些短肽可作為順式元件與內(nèi)含子RNA相互作用，增強其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和催化活性；隨著ORF變得更長，更為成熟，其編碼的蛋白質(zhì)不僅起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，亦獲得了DNA切割和逆轉(zhuǎn)錄活性，以替代RNA核酶行使催化功能。該成果不僅拓展了科學(xué)界對“RNA世界”假說和RNA催化功能的理解，也為創(chuàng)制具有我國完全自主知識產(chǎn)權(quán)的新型核酸操縱底盤工具，用于基因編輯和RNA編輯等，奠定了基礎(chǔ)。

生命中心PI劉俊杰為本文通訊作者；清華大學(xué)生命學(xué)院博士生劉子賢、高精尖結(jié)構(gòu)中心**學(xué)者張壽悅博士、博士生朱漢舟、博士后陳之航、博士生楊韻和博士生李隆騏為該文共同**作者；清華大學(xué)生命學(xué)院本科生劉云、博士生李丹苑、孫奧、李承平、譚順青、王高立、沈婕怡、水木學(xué)者靳帥博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究員和博士生雷源為本研究做出了大力貢獻。清華大學(xué)冷凍電鏡平臺為本研究提供了設(shè)備和技術(shù)支持。本研究得到了基金委原創(chuàng)項目(32150018)、農(nóng)業(yè)部和清華大學(xué)的經(jīng)費、資源支持。

生命中心劉俊杰課題組長期關(guān)注核酸酶機制研究及核酸操縱工具的開發(fā)、應(yīng)用。綜合運用生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)和細胞生物學(xué)手段，劉俊杰課題組及合作者已鑒定并開發(fā)了多種基因編輯工具(Cell, 2023; Nature, 2019; Mol. Cell, 2022; Cell Res., 2023) 。課題組長期招募對新型核酸操縱系統(tǒng)挖掘和RNA生物學(xué)感興趣，具有生物信息學(xué)、細胞生物學(xué)等學(xué)科背景的博士后。(實驗室網(wǎng)頁http://gogolab.life.tsinghua.edu.cn)。

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