開發基于RNA核酶的新型基因編輯工具

基因承載著遺傳信息，定義了生命的多樣性和復雜性。基因編輯是理解和改造生命的關鍵技術，在生物學研究和生物產業發展中發揮著重要作用。歷代基因編輯工具，如巨核酸酶、ZFNs、TALENs均以蛋白質為基礎，識別和切割DNA，編輯位點的重編程較為困難。目前被廣泛使用的CRISPR-Cas工具，是RNA引導的蛋白核酸酶，通過引導RNA的間隔序列來識別DNA，具有很好的編輯位點重編程能力，但依然存在著PAM序列限制、分子量大、蛋白免疫原性等多種問題。2024年2月1日，生命中心、清華大學生命學院劉俊杰(Jun-Jie Gogo Liu)課題組在Science雜志在線發表了題為Hydrolytic endonucleolytic ribozyme (HYER) is programmable for sequence-specific DNA cleavage的研究論文，報道了一種催化性RNA(核酶)—HYER(水解型內切核酶)。HYER可序列特異地切割RNA和DNA底物，并對哺乳動物細胞基因組產生位點特異的編輯。無需蛋白核酸酶的參與，HYER的底物識別和切割均由RNA分子實現，有望成為繼CRISPR之后，新一代的基因編輯底盤工具。

HYER源自細菌逆轉座子(第二類內含子，GII intron )，一種可在宿主基因組上“拷貝和粘貼”(逆轉座)的可移動元件。該元件通常編碼一個兼具核酸酶和逆轉錄酶活性的蛋白質，以及一個RNA分子，通過形成蛋白核酸復合物(RNP)來執行在宿主基因組中的逆轉座擴增。有趣的是，通過廣泛的生物信息學篩選，劉俊杰(Jun-Jie Gogo Liu)課題組發現了許多不編碼蛋白的、緊湊的二類C型內含子(ORF-less GII-C intron)在細菌基因組中存在多拷貝的現象。這一現象暗示，這些內含子編碼的**組份，RNA分子，可能具有不依賴蛋白的擴增位點識別和切割能力，來實現內含子在宿主基因組內的拷貝擴增。  

生化實驗表明，這些長度約600 nt的RNA分子在廣譜的離子濃度和溫度范圍內，具有顯著的RNA和DNA水解切割活性。因此，研究人員將這些RNA分子命名為水解型內切核酶(Hydrolytic Endonucleolytic Ribozymes, HYERs)，這是科學界**報道具有DNA水解切割能力的核酶(Ribozyme)。值得注意的是，HYER1和HYER2表現出了與緊湊型的CRISPR-Cas12e (CasX) 和Cas12l (Cas π)相當的DNA體外切割效率。為檢驗HYER在細胞內的DNA切割能力，研究人員在大腸桿菌中構建了ccdB毒蛋白報告系統，證明HYER1和HYER2可以對帶有ccdB毒基因的質粒進行靶向切割。在HEK293T細胞內，研究人員構建了移碼Puromycin抗性基因(puro*)報告系統。結果表明，HYER1可對puro*產生移碼編輯，賦予細胞Puromycin抗性。在抗性篩選富集后的細胞里，三個靶位點中最高的編輯效率為9.18%。這表明，HYER可以在真核細胞基因組中引入雙鏈斷裂并產生編輯。然而，在未經Puromycin篩選富集的細胞中，編輯效率僅為0.09%到0.2%，表明HYER的真核基因編輯能力還有很大的進步和優化空間。

研究人員利用冷凍電鏡獲得了HYER1的高分辨三維結構(3.0 ?)，發現HYER1以同源二聚體的形式存在，并揭示HYER1水解切割DNA的機理。HYER1通過一段暴露的單鏈RNA (6 nt)區域，TRS (Target Recognition Site)，識別并招募DNA底物，將DNA捕獲在結構域V所形成的催化核心中，通過經典的雙鎂離子機制催化DNA水解。  

基于HYER的三維結構，研究人員進行了多種理性設計，證明HYER具有良好的可編程性，可根據底物序列，靈活設計TRS的序列和長度；在TRS臨近區域插入14 nt 的底物招募序列(Recruiting Sequence, RS)，可明顯提高HYER1的底物識別特異性和切割效率；對回文序列和TRS進行改造， HYER1則可形成帶有兩個不同TRS的異源二聚體，靶向雙鏈DNA底物的不同區域，產生了具有5’突出、3’突出或平末端的定制化切割產物。  

有趣的是，受“RNA世界”假說的啟發，研究人員提出了第二類內含子中的“RNA的催化功能逐漸被蛋白質取代”的分子進化歷程：在進化過程中，第二類內含子的結構域IV逐漸擴大，并產生了可編碼短肽的開放閱讀框(ORF)，而這些短肽可作為順式元件與內含子RNA相互作用，增強其結構穩定性和催化活性；隨著ORF變得更長，更為成熟，其編碼的蛋白質不僅起到穩定結構的作用，亦獲得了DNA切割和逆轉錄活性，以替代RNA核酶行使催化功能。該成果不僅拓展了科學界對“RNA世界”假說和RNA催化功能的理解，也為創制具有我國完全自主知識產權的新型核酸操縱底盤工具，用于基因編輯和RNA編輯等，奠定了基礎。

生命中心PI劉俊杰為本文通訊作者；清華大學生命學院博士生劉子賢、高精尖結構中心**學者張壽悅博士、博士生朱漢舟、博士后陳之航、博士生楊韻和博士生李隆騏為該文共同**作者；清華大學生命學院本科生劉云、博士生李丹苑、孫奧、李承平、譚順青、王高立、沈婕怡、水木學者靳帥博士，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究員和博士生雷源為本研究做出了大力貢獻。清華大學冷凍電鏡平臺為本研究提供了設備和技術支持。本研究得到了基金委原創項目(32150018)、農業部和清華大學的經費、資源支持。

生命中心劉俊杰課題組長期關注核酸酶機制研究及核酸操縱工具的開發、應用。綜合運用生物信息學、結構生物學、生物化學和細胞生物學手段，劉俊杰課題組及合作者已鑒定并開發了多種基因編輯工具(Cell, 2023; Nature, 2019; Mol. Cell, 2022; Cell Res., 2023) 。課題組長期招募對新型核酸操縱系統挖掘和RNA生物學感興趣，具有生物信息學、細胞生物學等學科背景的博士后。(實驗室網頁http://gogolab.life.tsinghua.edu.cn)。

本網站所有轉載文章系出于傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與我們聯系，我們將立即進行刪除處理。