各國藥典對支原體qPCR檢測方法驗證的要求

各國藥典對支原體核酸擴增檢測方法（簡稱NAT法）的驗證要求略有出入，但均要求對最低檢出限、特異性和耐用性進行驗證。在檢測方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進行支原體檢測。

越來越多的廠商選擇使用商品化的支原體qPCR檢測試劑盒。

德國MB公司的支原體qPCR檢測試劑盒，被廣泛使用。Venor?GeM qEP利用定量、實時PCR (qPCR)快速(約3小時)和可靠的篩選細胞培養上清支原體污染。該試劑盒可與任何類型的實時PCR循環器結合使用，能夠檢測熒光染料FAM?和HEX?。特點：

①經典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求。

②高特異性，一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規定的9種支原體），根據序列一致性，至少可以檢測到107種支原體物種。操作簡單，易于觀察。

③高靈敏度，MB公司的支原體qPCR檢測試劑盒經典法最低檢測限可達到≤10CFU/ml。

④MB公司有相應配套的10CFU/100CFU的敏感度測試的標準品，便于方法學驗證。

⑤MB公司有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA，便于特異性驗證。

⑥MB公司有相應配套的支原體絕對定量標準品，便于最后定量檢測。

在使用商品化檢測試劑盒時，則除了需要試劑盒生產商提供完整的方法學驗證數據外，還需要使用者驗證試劑盒對其樣本的適用性，以及試劑盒表現出預期的性能（例如檢測限、耐用性、是否存在與細菌的交叉反應）。這些必須由使用者自己來證明。

在檢出限驗證中，歐洲藥典（簡稱EP）規定了污染細胞的常見9種支原體，要求NAT如替代培養法，對這9種支原體的檢測限需均達到10CFU/ml。其中如果生產中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關節液支原體（M. synoviae）。

日本藥典（簡稱JP）中的驗證要求與EP基本一致，但在最低檢出限驗證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗證。

最終待驗證的支原體物種的選擇，在依據藥典基礎上，還需根據支原體污染風險大小而定。污染風險的影響因素有支原體寄生的宿主細胞的特異性、原材料的來源、產品的應用領域等。

德國MB公司提供有10CFU支原體高敏標準品，可同時用于檢測限和耐用性的驗證。

在NAT法的特異性驗證方面，歐洲藥典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關系，應優先選擇進行驗證。

至于更具體的驗證方案，還需要使用者針對自己的產品以及流程自行設計，德國MB公司也可協助完善。