利用人工RNA spike-ins的技術，以提高植物基因活性分析的準確性

在基因表達分析中，例如RNA-seq（RNA測序），spike-ins被廣泛使用。在樣本制備的早期階段將spike-ins加入到樣本中。由于這些spike-ins的加入量是已知的，它們可以作為一個內部參照，幫助研究人員校正樣本處理和測序過程中可能出現的技術變異，如PCR擴增偏差、RNA降解或測序誤差等。

Spike-ins是一種實驗室技術，用于在生物學樣本中加入已知的、外源的控制分子，以監測和校正實驗過程中可能出現的變異和偏差。這些控制分子通常是合成的RNA或DNA片段，它們在序列上與目標生物樣本中的自然序列不同，因此不會與樣本中的任何自然分子發生混淆。

通過比較spike-ins的預期和實際測序讀數，研究人員可以評估和校正樣本中其他自然RNA分子的測序數據。這種方法提高了數據的準確性和可重復性，使得對基因表達水平的定量分析更加可靠。

Spike-ins的使用對于確保生物學研究結果的有效性和準確性至關重要，特別是在那些需要精確測量基因表達變化的實驗中，如疾病模型、藥物篩選、環境刺激響應等研究。通過這種方式，研究人員可以更準確地解釋實驗結果，從而得出更可靠的科學結論。

現在，研究人員發表了一種簡單的技巧，提升了我們理解外部因素（如溫度）如何影響植物基因活動的技術的精確度。

“這項研究實際上有兩個貢獻，”北卡羅來納州立大學分子與結構生物化學副教授Colleen Doherty表示，她是該研究論文的通訊作者。“首先，我們提高了植物研究界對一個許多人不熟悉的問題的認識，并強調了解決方案的重要性。其次，我們已經證明，解決這個問題可以顯著改變我們對植物基因活動的理解。”

RNA-seq分析技術面臨的挑戰

爭議的焦點是一種名為RNA-seq分析的技術，該技術用于測量基因活性的變化——也就是說，當基因活躍地轉錄以產生蛋白質時。

“我們利用RNA-seq分析來評估植物對各種刺激或環境變化的反應，”Doherty說。“這種技術之所以被廣泛使用，是因為它提供了一種相對簡單且成本較低的方法來監測植物的反應。”

例如，研究人員可以利用RNA-seq分析來觀察植物在干旱條件下哪些基因被激活，進而為培育抗旱新品種提供信息。然而，Doherty和她的合作者偶然發現了與RNA-seq分析相關的一個特殊挑戰。

識別并解決問題

Doherty說：“我們在一天中的不同時間監測植物對不同溫度的反應，結果卻大相徑庭。我們最初以為可能是我們做錯了什么。但當我們深入研究時，我們了解到在動物和酵母中已知的根據一天中的時間或氮剝奪等因素發生的轉錄全局變化。”

換句話說，研究人員希望觀察特定變量——比如溫度升高——是如何影響特定基因轉錄的。但是，有些變量——比如一天中的時間——可能會增加或減少所有基因的轉錄。這可能會讓研究人員難以就他們想要研究的具體變量得出結論。

DohertyDoherty說：“幸運的是，我們發現在研究非植物物種的學者中，這個問題已經得到了充分認識，他們已經開發出一種稱為人工spike-ins的方法來解釋它。這些以及類似的技術已經在植物科學的其他背景下使用過。但出于某種原因，當我們采用RNA-seq分析時，我們的領域并沒有將人工spike-ins納入我們的方法中。”

人工spike-ins的影響與潛力

人工spike-ins利用了與植物基因組中任何元素都不同的外源RNA片段，這意味著外源RNA不會與植物自身產生的任何物質混淆。研究人員在實驗開始時將外源RNA引入分析過程。由于轉錄的全局變化不會影響外源RNA，因此它可以作為一個固定的基準，使研究人員能夠確定植物自身產生的RNA總體上增加或減少的程度。

Doherty說：“當我們使用人工突變來解釋轉錄的全局變化時，我們發現植物在一天中不同時間暴露于溫度變化的差異實際上比我們預期的還要大。人工spike-ins為我們提供了更準確的信息，并讓我們更深入地了解了植物在夜間的行為——因為我們發現全球轉錄在夜間更高。在我們采用人工spike-ins信號之前，我們錯過了很多夜間發生的事情。人工spike-insspike-ins是一個優雅的解決方案，我們植物研究界的許多人甚至不知道這個挑戰的存在。我們樂觀地認為，這項技術將提高在各種可能影響植物物種全局轉錄的條件下轉錄分析的準確性。反過來，這可能有助于我們的研究界對我們研究的物種獲得新的見解。我們并沒有開發這種解決方案——人工spike-ins——但我們真的希望它能在植物科學中得到更廣泛的應用。”

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