創新單分子熒光成像FRETfluor標簽 用Cy3、Cy5和DNA構建27種標簽的新調色板

研究人員通常通過化學方式附著“熒光基團”來研究蛋白質或氨基酸等生物分子，當被激發后，在高倍顯微鏡成像下，這些熒光基團或標簽會呈現彩虹般的顏色，可以示蹤、可以幫助檢測疾病或識別遺傳條件，為研究人員提供了豐富的信息。

一次要檢測一種以上的分子——多重檢測，需要使用發出不同顏色光的其他類型的熒光基團。但是在單分子水平上區分不同的顏色是非常困難的。這就是為什么大多數顯微鏡只能看到三到四種顏色。雖然可以使用多種方法來突破這種限制——例如重復多輪標記成像洗脫，或者使用更多激光器的復雜設置。然而，想要用一種簡單而快速的方法來看到許多顏色仍然是一個主要的挑戰。

芝加哥大學普利茲克分子工程學院的研究人員在今天發表在《Nature Nanotechnology》期刊上的一篇論文中概述了一種解決這一挑戰的新方法。Squires實驗室概述的一項新技術，僅使用三種簡單的化學“模塊”——Cy3，Cy5和DNA，設計出數十個“FRETfluor”標簽，可以用來標記更多種生物分子。

“我們的方法更簡單。這是一次標記，一次成像，”共同**作者、芝加哥大學普利茲克分子工程博士候選人Jiachong Chu說。這意味著你可以事半功倍。目前，我們的新技術是該領域**的。”

通往多重檢測的新途徑

這一研究領域的最終目標——PME團隊的論文比以往任何時候都更接近的目標——是多重檢測。

紐鮑爾家族分子工程助理教授 Allison Squires說:“多重檢測意味著能夠在同一分析中檢測不止一種分子，你可能有10種、50種或數百種不同的蛋白質想要識別。”“有了這項新技術，我們可以檢測幾十個。我相信我們可以將其擴展到數百個。”

為了應對這一挑戰，Squires實驗室團隊發現了一種創新的新方法，使用一種成熟的技術：熒光共振能量轉移（FRET，F?rster resonance energy transfer）。FRET是一種描述能量如何在光敏分子之間傳遞的機制——一個熒光分子（供體）在被激發后，通過偶極相互作用，將其激發態能量非輻射地轉移到一個非常鄰近的分子（受體），使得受體分子激發，而供體分子回到基態。研究人員可以利用這個方法報告兩個分子何時靠近相互作用、衡量分子不同部分之間的距離。這一現象由德國物理學家Theodor F?rster在1948年提出。

“這個項目以一種新的方式利用了FRET，”**作者之一、化學博士候選人Ayesha Ejaz說。FRET通常用于測量距離和觀察生物分子的動力學。我們改變了供體和受體染料之間的間距，以創造不同的FRET效率和其他特性，我們用這些特性來識別不同的結構。”

PME團隊的研究中使用的27個標簽是27個“FRETfluors”，他們使用DNA，綠色熒光基團Cy3和紅色熒光基團Cy5，進行組合設計。作者首先創建了一系列“ABN”結構，將非磺化的Cy3和Cy5分別整合到“A”和“B”DNA鏈中，由6≤N≤20的N堿基對分隔(圖1a顯示AB9，ABN的N可以是6-20)。下方的“橋”鏈用于對核酸靶點進行序列特異性標記或添加用于常見標記化學的官能團。除了ABN，作者通過修改Cy3供體的DNA序列和連接化學鍵，以及添加額外的Cy3，構建了與ABN具有不同光物理性質的其他FRETfluor類型(圖1b)。與ABN結構相比，AB_sk的B_sk缺少Cy3和Cy5的未配對堿基，降低了Cy3的壽命和量子效率。A_cB的A_c在5 '端攜帶額外的單個Cy3，增加了亮度，降低了Cy3的凈壽命。AB_in的B_in在橋鏈的3′端和B鏈的5′端之間加入了一個額外的Cy3，增加了亮度，但對Cy3的凈壽命僅略有影響。Cy3和Cy5熒光基團的數量變化、熒光基團之間的距離微妙變化，都影響能量傳遞效率而導致產生能夠區分的不同光物理性質，除了發出不同顏色的光，每一種FRETfluor都表現出其他可調整的特性，這些特性使得研究人員可以在不到一秒的時間內識別出極低濃度下的FRETfluor。

FRETfluor設計使用最少的構建模塊（DNA和兩種熒光基團），利用染料光物理的位點特異性可調諧性作為額外的多重維度，從而組合擴展FRET的多重檢測能力。

Ejaz說：“通常，當人們想要同時觀察多種組分，比如一個細胞的不同部分，他們會用不同的熒光標簽給每個成分貼上不同的標簽，發出特定顏色的光。但可同時用的熒光標簽**于四到五種顏色，”“如果可以使用FRETfluor，那么我們可以增加可用于熒光顯微鏡的'顏色'的數量。我們目前正在測試FRETfluor在不同類型的實驗和環境中的工作情況，這將使我們更好地了解所有的可能性。”“這項研究的一個可能的未來方向是最終用這些FRETfluor取代普通的熒光基團標簽。

靈敏和簡單

新的多重檢測技術的吸引力主要來自于靈敏度和簡單性。“每個人都想讓自己喜歡的分析能夠多重化。”當時間充?；蛘邩颖静粫兓瘯r可以采用很多別的方法。“我們要解決的，是當你沒有太多時間，。。?；蛘吣阒挥泻苌僖稽c樣本、當每個分子流過你的通道時你只有一次機會來識別它們時。我們可以在不到一秒的時間內識別出低至數十飛摩爾濃度（femtomolar）的FRETfluors。”

簡單也是關鍵——可以使用普通的化學試劑來構建FRETfluors，可以用一種只需要單道激光就能讀取的技術。“我們只標記目標一次，只做一次讀數，”Chu說。“在這種情況下，我們可以同時創建和使用27個不同的標簽。”

Squires描述了現有技術如何與FRETfluors一起使用，以獲得更多的多重檢測的好處——“你可以引入特殊的激光激發方案，或者結合其他性質略有不同的熒光基團”——這將提高現有標簽的讀數。Squires說，將這些多重檢測工具應用到他們更強大的新技術中，可以開辟新的研究和應用領域。“成像和基于流動的生物醫學分析的這些改進將使下一代創新成為可能。”

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