原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法

原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)是一個涉及多個步驟的復(fù)雜過程，以下是對其培養(yǎng)方法的詳細(xì)闡述：

一、原理

原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)主要利用混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物分層生長的特性，以及小膠質(zhì)細(xì)胞半懸浮生長的特點(diǎn)，通過搖床震蕩法將皮層來源的混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物最上層的小膠質(zhì)細(xì)胞震搖下來繼續(xù)培養(yǎng)，以達(dá)到分離和純化小膠質(zhì)細(xì)胞的目的。

二、材料與儀器

材料：新生1-3天的仔鼠、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、D-PBS液、消化液（0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA）等。

儀器：37℃恒溫?fù)u床、離心機(jī)、顯微鏡、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、細(xì)胞濾網(wǎng)等。

三、步驟

準(zhǔn)備階段：按照培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法，待10天后細(xì)胞分層生長。此時顯微鏡下可見滿視野圓形、折光性強(qiáng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，附著在貼壁生長、緊密連接在一起的星形膠質(zhì)細(xì)胞層上面。

振搖階段：將培養(yǎng)瓶固定到37℃恒溫?fù)u床上，以80-200轉(zhuǎn)/分鐘的速度振搖2小時左右。

收集與種植：收集振搖下來的小膠質(zhì)細(xì)胞，種植到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，加入新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

換液與傳代：每2-3天更換一次培養(yǎng)基。如果根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要傳代培養(yǎng)，可以采用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)皿中，或用0.25%胰酶+0.04%的EDTA消化后進(jìn)行傳代。

四、質(zhì)量控制

可以通過流式細(xì)胞術(shù)分析樣品的純度、細(xì)胞活力甚至絕對計數(shù)，以確保所得小膠質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)量。

五、注意事項(xiàng)

所有步驟要無菌操作，以避免小膠質(zhì)細(xì)胞被污染或被微生物及毒素激活。

在振搖細(xì)胞之前，一定要確保底層的星形膠質(zhì)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶，并緊密連在一起，否則振搖過程中會將星形膠質(zhì)細(xì)胞層搖起。

六、常見問題

振搖分離出小膠質(zhì)細(xì)胞后，將新的培養(yǎng)液加入原培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)天后又會出現(xiàn)大量的小膠質(zhì)細(xì)胞，如此可以重復(fù)甚至更多次振搖收集小膠質(zhì)細(xì)胞。

由于小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目所占比例較小，在體外較難分裂增殖，故其產(chǎn)量不高。有文獻(xiàn)報道可以采用營養(yǎng)缺失法或加入單核細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）以增加產(chǎn)量。

綜上所述，原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)是一個需要精細(xì)操作的過程，通過合理的培養(yǎng)條件和步驟設(shè)置，可以獲得高質(zhì)量的小膠質(zhì)細(xì)胞，為后續(xù)的科研實(shí)驗(yàn)提供有力支持。