原代小膠質細胞培養方法

原代小膠質細胞培養是一個涉及多個步驟的復雜過程，以下是對其培養方法的詳細闡述：

一、原理

原代小膠質細胞培養主要利用混合膠質細胞培養物分層生長的特性，以及小膠質細胞半懸浮生長的特點，通過搖床震蕩法將皮層來源的混合膠質細胞培養物最上層的小膠質細胞震搖下來繼續培養，以達到分離和純化小膠質細胞的目的。

二、材料與儀器

材料：新生1-3天的仔鼠、含10%胎牛血清的DMEM培養基、D-PBS液、消化液（0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA）等。

儀器：37℃恒溫搖床、離心機、顯微鏡、培養瓶、培養皿、細胞濾網等。

三、步驟

準備階段：按照培養少突膠質細胞的方法，待10天后細胞分層生長。此時顯微鏡下可見滿視野圓形、折光性強的小膠質細胞，附著在貼壁生長、緊密連接在一起的星形膠質細胞層上面。

振搖階段：將培養瓶固定到37℃恒溫搖床上，以80-200轉/分鐘的速度振搖2小時左右。

收集與種植：收集振搖下來的小膠質細胞，種植到多聚賴氨酸包被的培養皿中，加入新的含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。

換液與傳代：每2-3天更換一次培養基。如果根據實驗需要傳代培養，可以采用細胞刮子刮下細胞接種到新的培養皿中，或用0.25%胰酶+0.04%的EDTA消化后進行傳代。

四、質量控制

可以通過流式細胞術分析樣品的純度、細胞活力甚至絕對計數，以確保所得小膠質細胞的質量。

五、注意事項

所有步驟要無菌操作，以避免小膠質細胞被污染或被微生物及毒素激活。

在振搖細胞之前，一定要確保底層的星形膠質細胞鋪滿培養瓶，并緊密連在一起，否則振搖過程中會將星形膠質細胞層搖起。

六、常見問題

振搖分離出小膠質細胞后，將新的培養液加入原培養瓶中繼續培養，數天后又會出現大量的小膠質細胞，如此可以重復甚至更多次振搖收集小膠質細胞。

由于小膠質細胞數目所占比例較小，在體外較難分裂增殖，故其產量不高。有文獻報道可以采用營養缺失法或加入單核細胞集落刺激因子（M-CSF）以增加產量。

綜上所述，原代小膠質細胞培養是一個需要精細操作的過程，通過合理的培養條件和步驟設置，可以獲得高質量的小膠質細胞，為后續的科研實驗提供有力支持。