新方法大大擴展單分子測序的應(yīng)用

近年來，以單分子分辨率研究個體DNA的技術(shù)極大地擴展了我們對人類基因組、微生物組和疾病遺傳基礎(chǔ)的了解。有了如此詳細的DNA視圖，我們能夠觀察到以往無法檢測的基因變異和結(jié)構(gòu)細節(jié)。

然而，如今單分子分析的標準方法至少需要1-5 μg起始DNA。這意味著研究人員無法在樣本量有限的情況下使用這些工具，比如液體活檢（只有數(shù)千個細胞），這限制了這些技術(shù)的科研和臨床潛力。

近日，格拉斯通研究所（Gladstone Institutes）的研究人員開發(fā)出兩種新的單分子分析工具，可將所需樣本量減少90%到95%。這項研究成果發(fā)表在《Nature Genetics》雜志上，展示了這些工具如何幫助科學(xué)家們解決以前無法回答的生物學(xué)問題。

對DNA進行片段化+標記

**種新工具被稱為SMRT-Tag（基于轉(zhuǎn)座酶片段化的單分子實時測序）。它能夠確定長片段DNA中的堿基序列，并繪制甲基基團的位置。甲基基團在基因表達中起著關(guān)鍵作用，對了解疾病至關(guān)重要，因此研究人員想了解它們在DNA上的配置。

共同通訊作者、格拉斯通研究所的助理研究員Vijay Ramani博士表示：“當我們只有很少的DNA時，我們不能復(fù)制更多的拷貝，并使用我們以往的實驗方案。復(fù)制DNA會導(dǎo)致甲基化模式丟失，并引入其他錯誤。”

相反，他的團隊采用了一種名為“轉(zhuǎn)座酶片段化（tagmentation）”的方法，這種方法利用細菌Tn5轉(zhuǎn)座酶，將DNA分子切割成更容易處理的片段，同時對進一步分析所需的化學(xué)成分進行標記。

研究人員面臨的挑戰(zhàn)是，如何利用轉(zhuǎn)座酶片段化的化學(xué)試劑將少量的DNA打斷成3 kb-5 kb的長片段。他們的方法使用發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)“標記”每個片段的末端，形成DNA長環(huán)，以便測序儀可靠讀取。

“我們實驗室的師生們付出了巨大的努力，” Ramani談道。“我們必須測試不同版本的Tn5以及近100種不同的條件，包括緩沖液、酶和溫度。當你處理少量的DNA時，任何導(dǎo)致DNA丟失的操作都會讓事情變得更加棘手。”

獲得可行動的數(shù)據(jù)

對SMRT-Tag進行優(yōu)化后，研究團隊證明了它的表現(xiàn)與現(xiàn)有的方案一樣出色，但DNA使用量要少得多——大約只需要40 ng DNA，相當于7 x 10⁴個細胞。

“使用PacBio的單分子測序儀，從來沒有人對如此少量的DNA進行測序，并達到我們目前的覆蓋度，” Ramani談道。

接下來，研究人員將SMRT-Tag與他們之前開發(fā)的一種名為SAMOSA的方法相結(jié)合，SAMOSA代表了“單分子腺嘌呤甲基化寡核苷酸測序分析”，它能夠揭示甲基化模式，這些模式反映了染色質(zhì)可及性。

現(xiàn)在，有了這種新的SAMOSA-Tag工具，他們能夠用少量的DNA來評估染色質(zhì)可及性。為了證明這一點，他們將其應(yīng)用于移植到小鼠體內(nèi)的前列腺癌細胞上。這種方法揭示了原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間的染色質(zhì)可及性差異，暗示了癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動因素。

共同領(lǐng)導(dǎo)這項研究的Siva Kasinathan博士稱：“這只是一個例子，說明我們的工具可以應(yīng)用在癌癥及其他疾病的臨床相關(guān)樣本上，因為在這些情景下，DNA是短缺的。我們認為有一些容易獲得的成果，可以解鎖新的生物學(xué)知識，這對幫助今后的患者很重要。”

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