新研究揭示γ-分泌酶識別并切割底物的分子機制

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease, AD）是目前世界上患病最廣泛的神經退行性疾病，其病理特征之一是病人腦組織中出現的淀粉樣斑塊沉積。這些斑塊被認為是由β-淀粉樣蛋白（amyloid-β peptides，Aβ）逐漸聚集形成的，而Aβ則來源于對淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein, APP）的切割，其中γ-分泌酶（γ-secretase）在切割APP產生不同長度的Aβ過程中發揮著關鍵作用。

  γ-分泌酶是由Presenilin（PS）、PEN-2、APH-1和Nicastrin（NCT）四個亞基共同組成的膜內蛋白酶復合物。遺傳學證據表明，可遺傳的家族性AD所攜帶的基因突變主要位于APP以及PS1/PS2基因上。APP首先被β-分泌酶切割為99個殘基的肽段（APP-C99）,APP-C99可以被γ-分泌酶通過內肽酶活性切割為49個殘基的Aβ49或48個殘基的Aβ48,隨后γ-分泌酶發揮羧肽酶活性，繼續將Aβ49切割產生Aβ46、Aβ43和Aβ40；對Aβ48的切割產生Aβ45、Aβ42和Aβ38 (1)。

  Aβ聚集被認為與AD的發生密切相關，因此清除淀粉樣蛋白是治療AD的潛在策略。2023年7月，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準針對Aβ聚合體的單克隆抗體Lecanemab（侖卡奈單抗）用于AD治療。然而，這些不同長度的Aβ是如何被γ-分泌酶依次剪切的，領域內提出了多種模型來猜想這一分步切割的動態過程，遺憾的是，到目前為止，這一問題仍然懸而未決，極大地限制了對AD病理的理解以及針對Aβ和γ-分泌酶的藥物研發設計。

2024年6月7日，生命科學聯合中心/清華大學生命學院/西湖大學/北京生物結構前沿研究中心施一公教授團隊在《科學》（Science）發表最新研究成果：《人源γ-分泌酶識別和剪切底物的分子機制》（Molecular Mechanism of Substrate Recognition and Cleavage by Human γ-Secretase）。論文報道了γ-分泌酶結合切割過程中四種中間態底物APP-C99、Aβ49、Aβ46和Aβ43的冷凍電鏡結構，揭示了γ-分泌酶識別底物的分子機理，并通過這些結構的深入比較，提出“活塞模型（piston model）”來解釋γ-分泌酶動態切割底物的過程。這項研究解決了AD領域困擾多年的關于γ-分泌酶切割機制的難題，對于理解Aβ產生過程以及發展新的治療策略具有廣泛的意義。

由于酶與底物的結合-酶切-解離的過程極其動態，獲得酶與底物的復合物結構難度非常大，作者引入了兩個策略：1.經過大量篩選，分別在底物近膜區和酶NCT亞基上引入半胱氨酸突變,通過二硫鍵交聯穩定復合物；2.將酶催化殘基之一385位天冬氨酸（Asp385）突變為天冬酰胺（Asn），既防止底物的切割，又可以模擬催化水解的中間狀態。利用該方法，作者首先獲得了γ-分泌酶-APP-C99的原子分辨率結構：APP-C99包含α-螺旋區、β-strand區以及介于兩者之間的鉸鏈區，底物β-strand與PS1形成穩定的β-sheet結構，而酶切位點恰好在β-strand之前，繼而切割產生Aβ49作為產物以進行后續剪切。

利用相似的策略，結合一系列提高交聯效率的方法，作者成功獲取了γ-分泌酶-Aβ49的結構：Aβ49同樣包含α-螺旋區、β-strand區以及介于兩者之間的鉸鏈區，不同的是Aβ49的β-strand僅由三個氨基酸殘基組成，而切割位點也位于β-strand之前，這樣可以成功釋放三肽并產生Aβ46。三個氨基酸組成的短的β-strand解釋了γ-分泌酶以每次剪切三個氨基酸為主的羧肽酶活性。隨后，作者利用體外重構的方法又解析了γ-分泌酶分別結合Aβ46和Aβ43的冷凍電鏡結構，Aβ46/Aβ43與Aβ49的結構特征非常相似。

雖然之前該研究組已經報道了γ-分泌酶分別結合Notch和APP-C83的結構 (2, 3)，但是該研究的創新性在于，作者通過多種中間態底物結構的比較分析，總結了γ-分泌酶識別和切割底物的動態過程。從局部結構特征和催化機制的角度來看，γ-分泌酶的內肽酶和羧肽酶活性之間幾乎沒有差異，主要區別在于底物形成β-strand的長度：對于Aβ49的產生，C99形成比較長的β-strand區域；對于羧肽酶切割（Aβ49→Aβ46→Aβ43→Aβ40），底物β-strand區僅包含三個連續的氨基酸殘基。隨著底物向細胞內側移位進行切割，底物跨膜α-螺旋區保持其整體長度，每次切割后，底物α-螺旋區向前擰動和轉位一個螺旋（大約3個氨基酸），并形成一個新的β-strand，這種機制被總結為“活塞模型”。

活塞模型包括兩個基本原則：1.底物β-strand引導下一個切割位點。因為至少需要三個殘基才能形成β-strand，所以解釋了為什么Aβ49或Aβ48的切割大多是以三個殘基的步驟進行的。2.每個底物在γ-分泌酶切割過程中展示了相同的結構特征，包括一個被PS1識別的跨膜α-螺旋區，引導底物切割的β-strand區，以及介于之間的連接序列。這一模型可以解釋很多之前文獻中報道的生化數據，包括家族性AD基因突變的影響，以及γ-分泌酶對其他100多種底物的切割模式等，為γ-分泌酶的機制研究以及針對γ-分泌酶的藥物設計和優化提供重要依據。

生命中心PI施一公實驗室一直以來都將揭示AD發病機理作為重點研究方向，其中γ-分泌酶的三維結構及其作用機理的解析是一項重要的分支。2014-2015年，該組先后在Nature報道了分辨率為4.5 ?及3.4 ?人源γ-分泌酶的三維結構 (4, 5)。2018-2019年，分別在Nature和Science發表論文報道了γ-分泌酶結合重要底物Notch和APP-C83的三維結構 (2, 3)。2021年，在Cell雜志報道了γ-分泌酶結合小分子抑制劑和調節劑的原子分辨率結構，闡明了γ-分泌酶識別小分子藥物的分子機理 (6)。此次發表在Science的研究是在之前研究基礎上γ-分泌酶領域的又一次進步與突破。

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