熒光定量PCR的詳細(xì)步驟

熒光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR）是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。以下是熒光定量PCR的詳細(xì)步驟：

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

樣本準(zhǔn)備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求準(zhǔn)備待檢測(cè)的樣本，如細(xì)胞、組織或血液等。

試劑準(zhǔn)備：包括引物、模板DNA/RNA、熒光染料或探針（如SYBR Green I或TaqMan探針）、dNTPs、酶（如Taq酶）、Mg2+、緩沖液等。

二、RNA提取（如果檢測(cè)的是RNA）

細(xì)胞裂解：取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

兩相分離：向樣品中加入氯仿，劇烈振蕩后離心，使樣品分為三層，RNA存在于上層水相中。

RNA沉淀：將上層水相轉(zhuǎn)移至新管，加入異丙醇沉淀RNA，離心后得到RNA沉淀。

RNA清洗：用75%乙醇清洗RNA沉淀，去除雜質(zhì)。

RNA干燥與溶解：將RNA沉淀干燥后，用無(wú)RNA酶的水溶解。

三、RNA濃度與純度測(cè)定

使用分光光度計(jì)：測(cè)定RNA在260nm和280nm處的吸光度，計(jì)算RNA的濃度和純度（A260/A280比值應(yīng)在1.8到2.1之間）。

四、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（如果檢測(cè)的是RNA）

配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：包括逆轉(zhuǎn)錄buffer、引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV、DEPC水、RNA模板等。

進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將反應(yīng)液放入PCR儀中，按設(shè)定程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。

五、熒光定量PCR

配置qPCR反應(yīng)體系：包括熒光染料或探針、上下游引物、dNTPs、Taq酶、模板DNA/cDNA、緩沖液等。

設(shè)置熱循環(huán)參數(shù)：通常包括預(yù)變性（如93℃ 2分鐘）、變性（如93℃ 1分鐘）、復(fù)性（如55℃ 1分鐘）和延伸（如72℃ 1分鐘）等步驟，共進(jìn)行多個(gè)循環(huán)（如40個(gè)循環(huán)）。

上機(jī)實(shí)驗(yàn)：將配置好的反應(yīng)液加入PCR儀中，啟動(dòng)程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。

數(shù)據(jù)分析：根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制擴(kuò)增曲線，計(jì)算Ct值，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本中目的基因的拷貝數(shù)。

六、注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則，避免污染。

引物設(shè)計(jì)應(yīng)合理，確保特異性和高效性。

反應(yīng)體系配置應(yīng)準(zhǔn)確，避免誤差。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意觀察儀器狀態(tài)，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

數(shù)據(jù)分析應(yīng)準(zhǔn)確可靠，避免誤判。

以上步驟僅供參考，具體實(shí)驗(yàn)步驟可能因?qū)嶒?yàn)條件、試劑種類和儀器型號(hào)等因素而有所不同。在實(shí)際操作中，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體情況和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。