熒光定量PCR的詳細步驟

熒光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR）是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，并通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。以下是熒光定量PCR的詳細步驟：

一、實驗前準備

樣本準備：根據實驗需求準備待檢測的樣本，如細胞、組織或血液等。

試劑準備：包括引物、模板DNA/RNA、熒光染料或探針（如SYBR Green I或TaqMan探針）、dNTPs、酶（如Taq酶）、Mg2+、緩沖液等。

二、RNA提取（如果檢測的是RNA）

細胞裂解：取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

兩相分離：向樣品中加入氯仿，劇烈振蕩后離心，使樣品分為三層，RNA存在于上層水相中。

RNA沉淀：將上層水相轉移至新管，加入異丙醇沉淀RNA，離心后得到RNA沉淀。

RNA清洗：用75%乙醇清洗RNA沉淀，去除雜質。

RNA干燥與溶解：將RNA沉淀干燥后，用無RNA酶的水溶解。

三、RNA濃度與純度測定

使用分光光度計：測定RNA在260nm和280nm處的吸光度，計算RNA的濃度和純度（A260/A280比值應在1.8到2.1之間）。

四、反轉錄合成cDNA（如果檢測的是RNA）

配置反轉錄反應體系：包括逆轉錄buffer、引物、dNTPs、逆轉錄酶MMLV、DEPC水、RNA模板等。

進行反轉錄反應：將反應液放入PCR儀中，按設定程序進行反轉錄，得到cDNA。

五、熒光定量PCR

配置qPCR反應體系：包括熒光染料或探針、上下游引物、dNTPs、Taq酶、模板DNA/cDNA、緩沖液等。

設置熱循環參數：通常包括預變性（如93℃ 2分鐘）、變性（如93℃ 1分鐘）、復性（如55℃ 1分鐘）和延伸（如72℃ 1分鐘）等步驟，共進行多個循環（如40個循環）。

上機實驗：將配置好的反應液加入PCR儀中，啟動程序進行實時熒光檢測。

數據分析：根據熒光信號強度變化繪制擴增曲線，計算Ct值，并通過標準曲線計算待測樣本中目的基因的拷貝數。

六、注意事項

實驗操作應嚴格遵循無菌原則，避免污染。

引物設計應合理，確保特異性和高效性。

反應體系配置應準確，避免誤差。

實驗過程中應注意觀察儀器狀態，確保實驗順利進行。

數據分析應準確可靠，避免誤判。

以上步驟僅供參考，具體實驗步驟可能因實驗條件、試劑種類和儀器型號等因素而有所不同。在實際操作中，應根據實驗室的具體情況和實驗需求進行調整。