原代培養之組織塊培養法＋消化培養法操作步驟及注意事項

原代培養也叫初代培養，是從供體取得組織細胞后在體外進行的**培養。原代培養方法有很多，常用的有組織塊法和消化法。

組織塊培養法

操作步驟：

處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2-3次，去除血污。

剪切：用眼科剪把組織切成2mm3左右的塊。

鋪瓶：將剪切好的組織小塊，用眼科鑷或吸管送入培養瓶內，每小塊間距約5mm，均勻鋪在瓶底。

輕輕翻轉培養瓶，使瓶底朝上，然后于瓶內加入適量培養基蓋好瓶塞，將瓶傾斜放置在37℃溫箱內；2~4h待組織小塊貼附后，將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養；
約24h后補液，3~5d可換液，7-9d便開始有細胞從組織塊周圍爬出。

注意事項:

1.剪切組織時可滴加1~2滴含血清培養液，可減少組織快漂浮。

2.如懷疑組織污染，可先置于含有青鏈霉素

的混合液中浸潤30min。

3.瓶壁均勻擺置，25m工培養瓶約接種20~30

小塊為宜。

4.觀察和移動過程中注意要動作輕巧，盡量不要引起液體的振蕩而產生對組織塊的沖擊力使其漂起:

5.若組織塊不易貼壁可預先在瓶底壁涂薄層血清或鼠尾膠原等以增加組織塊黏附力。

6.原代培養的1~2d內要特別注意觀察是否有細菌、霉菌等的污染。

7.對原代培養要及時觀察，發現細胞游出后要記錄。

8.原代培養3~5d換液，瓶中漂浮的組織塊和殘留的血細胞或細胞生長較多時，全部更換新鮮培養液，細胞較少時，可換半培養液已漂浮的組織塊和細胞碎片，含有有害物質，會影響原代細胞的活力和生長，應及時清除。

消化培養法

操作步驟：

處理組織：用Hanks液漂洗組織2~3次，去除血污；

剪切：用眼科剪把組織切成2mm3左右的塊。加入比組織塊總量多3-5倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入培養皿中。

消化：置于37℃溫箱消化，每隔20分鐘搖動一次。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

分離：在消化過程中見消化液混濁時，吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000rpm）離心5min，收集細胞，棄上清。

加入適量培養基重懸細胞，裝入培養瓶中，補足培養基。

培養：計數后，置于37℃,5%CO2培養箱培養。

注意事項:

1.如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30min。

2.根據組織類型選擇適宜的消化酶，尤其是注意選擇適當類型的膠原酶。

3.控制消化時間，避免消化過度，造成細胞膜損傷，從而影響細胞貼壁及生長。

4.**進行原代培養時，適當提高接種細胞密度，有助于提高培養成活率。