測試數千種RNA酶有助于在哺乳動物中新發現“扭曲核酶”

賓州大學公園“RNA世界”假說提出，地球上最早的生命可能是基于RNA——一種在許多方面與DNA相似的單鏈分子——就像一些現代病毒一樣。這是因為，像DNA一樣，RNA可以攜帶遺傳信息，但像蛋白質一樣，它也可以作為一種酶，啟動或加速反應。雖然一些核糖核酸酶（核糖酶）的活性已經在個案基礎上進行了測試，但通過計算預測，從細菌到植物和動物的生物體中存在著數千種以上的核糖核酸酶。現在，賓夕法尼亞州立大學的研究人員開發了一種新方法，可以在一次實驗中測試數千種預測核酶的活性。

研究小組測試了2600多種不同的RNA序列的活性，這些序列被預測屬于一類被稱為“扭曲核酶”的RNA酶，這種酶有能力將自己切成兩半。大約94%的測試核酶是活躍的，研究表明，即使它們的結構有輕微的缺陷，它們的功能也能持續存在。研究小組還在哺乳動物中發現了**個扭轉核酶的例子，特別是在寬吻海豚的基因組中。

這篇描述這項研究的論文發表在11月5日的《核酸研究》雜志上。

“DNA是一種雙鏈分子，通常形成簡單的螺旋結構，而RNA是單鏈分子，可以自我折疊，形成多種結構，包括環狀、凸起和螺旋，”賓夕法尼亞州立大學埃伯利科學學院化學、生物化學和分子生物學杰出教授、研究小組負責人菲爾·貝維拉夸（Phil Bevilacqua）說。“RNA酶的功能是基于這些結構的，它們被分為幾個不同的類別。我們選擇專注于所謂的‘扭曲核酶’，因為它們的功能之一是將自己一分為二，我們可以通過確定它們的基因序列來看到這一點。”

在這項研究之前，基于基因組序列和對結構的預測，已經提出了大約1600種扭轉核酶，但只有少數得到了實驗驗證。該團隊開發了一種實驗管道，使他們能夠在一次實驗中評估數千種核酶的自切割活性，他們稱之為“切割高通量測定”，簡稱CHiTA。他們還通過精心手工搜索1000種生物體基因組中許多核酶共享的短而高度保守的序列的基因組背景，確定了大約1000種額外的扭轉核酶候選物。

CHiTA依賴于兩個關鍵因素。一種是最近開發的一種技術，稱為“大規模平行寡核苷酸合成”（MPOS）。MPOS使研究團隊能夠設計并購買數千種不同的核糖酶序列，這些序列以DNA小片段的形式存在于一個小瓶中。他們設計的每一個序列都以2600個預測的核酶序列中的一個為核心。然后，研究人員在兩端添加短段DNA，使他們能夠復制DNA并將其轉錄成RNA以測試其活性。

“有了MPOS，我們可以簡單地用我們感興趣的序列創建一個電子表格，把它發送給商業供應商，他們給我們寄回一個包含每個序列少量的試管，”勞倫·麥金利（Lauren McKinley）說，她是賓夕法尼亞州立大學（Penn State）的研究生，最近獲得了博士學位，是該論文的**作者。“對于CHiTA，我們需要大量的每個序列，所以我們在序列的每一端添加DNA片段，使我們能夠使用一種稱為PCR的技術制造數百萬個副本，但這些額外的片段可能會影響我們測試核酶功能的能力。”

CHiTA的第二個關鍵因素有助于克服這一障礙，它使用一種稱為限制性內切酶的蛋白質去除這些附加的序列片段，這種蛋白質在稱為識別位點的特定短序列上切割DNA。然而，大多數限制性內切酶在其識別位點的中間附近切割DNA，留下一部分識別位點序列附著在兩個產生的DNA片段上，這仍然可能影響核酶的結構和功能。

麥金利說：“我們發現了一種限制性內切酶，它可以在距離識別位點很近的地方切割DNA，所以我們可以設計我們的序列，這樣它就不會留下額外DNA的痕跡。”“通過這種方式，我們可以確保我們正在評估核酶精確序列的功能。”

在實驗室里，研究小組首先對通過MPOS排序的序列進行額外的復制，用限制性內切酶修剪任何額外的DNA，然后他們可以從DNA序列中轉錄RNA。如果其中任何一個序列編碼活性核酶，當RNA產生時，它們將迅速折疊成其功能結構并自我切割。然后，研究人員可以收集RNA并將其轉化為DNA（稱為cDNA），這樣他們就可以讀取其序列，看看它是全長還是已被切割。麥金利說：“當我們對cDNA進行測序時，我們可以看到有多少RNA被切割，如果有的話，作為核酶活性的一個指標。”“在我們測試的大約94%的序列中，相當一部分RNA被切割。事實上，每種活性核酶被切割的百分比與早期單獨測試核酶的努力非常相似。”

然后，研究小組觀察了他們測試的序列的預測結構，發現其中許多序列與標準的扭曲核酶結構相比有輕微的變化或缺陷，但它們仍然是自裂的。這向研究人員表明，核酶的功能對輕微的結構變化非常耐受，這意味著即使結構不完美，它們仍然可以起作用。

研究小組認為，對不完美的容忍表明，自然界中可能隱藏著更多的扭曲，而這些扭曲是使用原始搜索參數無法發現的。事實上，在這項研究中，基于序列的新描述符使研究小組發現了**個哺乳動物的扭轉核酶，這是在寬吻海豚的基因組中發現的。

Bevilacqua說：“了解這些類型的對核酶序列和結構變化的耐受性將有助于我們設計新的和嚴格的方法來識別它們。”“我們目前對核酶功能的了解主要基于化學，我們才剛剛開始了解它們在生物學中的作用。能夠在像CHiTA這樣的大規模試驗中測試它們的活性，將有望加快我們發現新的核酶的能力，并更好地了解它們在細胞中所起的作用。所有這些也可以幫助我們及時回溯，看看當RNA的能力可能是早期地球生命啟動的關鍵時，可能會發生什么。”

本網站所有轉載文章系出于傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與我們聯系，我們將立即進行刪除處理。