測(cè)試數(shù)千種RNA酶有助于在哺乳動(dòng)物中新發(fā)現(xiàn)“扭曲核酶”

賓州大學(xué)公園“RNA世界”假說(shuō)提出，地球上最早的生命可能是基于RNA——一種在許多方面與DNA相似的單鏈分子——就像一些現(xiàn)代病毒一樣。這是因?yàn)椋馜NA一樣，RNA可以攜帶遺傳信息，但像蛋白質(zhì)一樣，它也可以作為一種酶，啟動(dòng)或加速反應(yīng)。雖然一些核糖核酸酶（核糖酶）的活性已經(jīng)在個(gè)案基礎(chǔ)上進(jìn)行了測(cè)試，但通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)，從細(xì)菌到植物和動(dòng)物的生物體中存在著數(shù)千種以上的核糖核酸酶。現(xiàn)在，賓夕法尼亞州立大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種新方法，可以在一次實(shí)驗(yàn)中測(cè)試數(shù)千種預(yù)測(cè)核酶的活性。

研究小組測(cè)試了2600多種不同的RNA序列的活性，這些序列被預(yù)測(cè)屬于一類被稱為“扭曲核酶”的RNA酶，這種酶有能力將自己切成兩半。大約94%的測(cè)試核酶是活躍的，研究表明，即使它們的結(jié)構(gòu)有輕微的缺陷，它們的功能也能持續(xù)存在。研究小組還在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了**個(gè)扭轉(zhuǎn)核酶的例子，特別是在寬吻海豚的基因組中。

這篇描述這項(xiàng)研究的論文發(fā)表在11月5日的《核酸研究》雜志上。

“DNA是一種雙鏈分子，通常形成簡(jiǎn)單的螺旋結(jié)構(gòu)，而RNA是單鏈分子，可以自我折疊，形成多種結(jié)構(gòu)，包括環(huán)狀、凸起和螺旋，”賓夕法尼亞州立大學(xué)埃伯利科學(xué)學(xué)院化學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)杰出教授、研究小組負(fù)責(zé)人菲爾·貝維拉夸（Phil Bevilacqua）說(shuō)。“RNA酶的功能是基于這些結(jié)構(gòu)的，它們被分為幾個(gè)不同的類別。我們選擇專注于所謂的‘扭曲核酶’，因?yàn)樗鼈兊墓δ苤皇菍⒆约阂环譃槎覀兛梢酝ㄟ^(guò)確定它們的基因序列來(lái)看到這一點(diǎn)。”

在這項(xiàng)研究之前，基于基因組序列和對(duì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，已經(jīng)提出了大約1600種扭轉(zhuǎn)核酶，但只有少數(shù)得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種實(shí)驗(yàn)管道，使他們能夠在一次實(shí)驗(yàn)中評(píng)估數(shù)千種核酶的自切割活性，他們稱之為“切割高通量測(cè)定”，簡(jiǎn)稱CHiTA。他們還通過(guò)精心手工搜索1000種生物體基因組中許多核酶共享的短而高度保守的序列的基因組背景，確定了大約1000種額外的扭轉(zhuǎn)核酶候選物。

CHiTA依賴于兩個(gè)關(guān)鍵因素。一種是最近開發(fā)的一種技術(shù)，稱為“大規(guī)模平行寡核苷酸合成”（MPOS）。MPOS使研究團(tuán)隊(duì)能夠設(shè)計(jì)并購(gòu)買數(shù)千種不同的核糖酶序列，這些序列以DNA小片段的形式存在于一個(gè)小瓶中。他們?cè)O(shè)計(jì)的每一個(gè)序列都以2600個(gè)預(yù)測(cè)的核酶序列中的一個(gè)為核心。然后，研究人員在兩端添加短段DNA，使他們能夠復(fù)制DNA并將其轉(zhuǎn)錄成RNA以測(cè)試其活性。

“有了MPOS，我們可以簡(jiǎn)單地用我們感興趣的序列創(chuàng)建一個(gè)電子表格，把它發(fā)送給商業(yè)供應(yīng)商，他們給我們寄回一個(gè)包含每個(gè)序列少量的試管，”勞倫·麥金利（Lauren McKinley）說(shuō)，她是賓夕法尼亞州立大學(xué)（Penn State）的研究生，最近獲得了博士學(xué)位，是該論文的**作者。“對(duì)于CHiTA，我們需要大量的每個(gè)序列，所以我們?cè)谛蛄械拿恳欢颂砑覦NA片段，使我們能夠使用一種稱為PCR的技術(shù)制造數(shù)百萬(wàn)個(gè)副本，但這些額外的片段可能會(huì)影響我們測(cè)試核酶功能的能力。”

CHiTA的第二個(gè)關(guān)鍵因素有助于克服這一障礙，它使用一種稱為限制性內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)去除這些附加的序列片段，這種蛋白質(zhì)在稱為識(shí)別位點(diǎn)的特定短序列上切割DNA。然而，大多數(shù)限制性內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)的中間附近切割DNA，留下一部分識(shí)別位點(diǎn)序列附著在兩個(gè)產(chǎn)生的DNA片段上，這仍然可能影響核酶的結(jié)構(gòu)和功能。

麥金利說(shuō)：“我們發(fā)現(xiàn)了一種限制性內(nèi)切酶，它可以在距離識(shí)別位點(diǎn)很近的地方切割DNA，所以我們可以設(shè)計(jì)我們的序列，這樣它就不會(huì)留下額外DNA的痕跡。”“通過(guò)這種方式，我們可以確保我們正在評(píng)估核酶精確序列的功能。”

在實(shí)驗(yàn)室里，研究小組首先對(duì)通過(guò)MPOS排序的序列進(jìn)行額外的復(fù)制，用限制性內(nèi)切酶修剪任何額外的DNA，然后他們可以從DNA序列中轉(zhuǎn)錄RNA。如果其中任何一個(gè)序列編碼活性核酶，當(dāng)RNA產(chǎn)生時(shí)，它們將迅速折疊成其功能結(jié)構(gòu)并自我切割。然后，研究人員可以收集RNA并將其轉(zhuǎn)化為DNA（稱為cDNA），這樣他們就可以讀取其序列，看看它是全長(zhǎng)還是已被切割。麥金利說(shuō)：“當(dāng)我們對(duì)cDNA進(jìn)行測(cè)序時(shí)，我們可以看到有多少RNA被切割，如果有的話，作為核酶活性的一個(gè)指標(biāo)。”“在我們測(cè)試的大約94%的序列中，相當(dāng)一部分RNA被切割。事實(shí)上，每種活性核酶被切割的百分比與早期單獨(dú)測(cè)試核酶的努力非常相似。”

然后，研究小組觀察了他們測(cè)試的序列的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其中許多序列與標(biāo)準(zhǔn)的扭曲核酶結(jié)構(gòu)相比有輕微的變化或缺陷，但它們?nèi)匀皇亲粤训摹＿@向研究人員表明，核酶的功能對(duì)輕微的結(jié)構(gòu)變化非常耐受，這意味著即使結(jié)構(gòu)不完美，它們?nèi)匀豢梢云鹱饔谩?/span>

研究小組認(rèn)為，對(duì)不完美的容忍表明，自然界中可能隱藏著更多的扭曲，而這些扭曲是使用原始搜索參數(shù)無(wú)法發(fā)現(xiàn)的。事實(shí)上，在這項(xiàng)研究中，基于序列的新描述符使研究小組發(fā)現(xiàn)了**個(gè)哺乳動(dòng)物的扭轉(zhuǎn)核酶，這是在寬吻海豚的基因組中發(fā)現(xiàn)的。

Bevilacqua說(shuō)：“了解這些類型的對(duì)核酶序列和結(jié)構(gòu)變化的耐受性將有助于我們?cè)O(shè)計(jì)新的和嚴(yán)格的方法來(lái)識(shí)別它們。”“我們目前對(duì)核酶功能的了解主要基于化學(xué)，我們才剛剛開始了解它們?cè)谏飳W(xué)中的作用。能夠在像CHiTA這樣的大規(guī)模試驗(yàn)中測(cè)試它們的活性，將有望加快我們發(fā)現(xiàn)新的核酶的能力，并更好地了解它們?cè)诩?xì)胞中所起的作用。所有這些也可以幫助我們及時(shí)回溯，看看當(dāng)RNA的能力可能是早期地球生命啟動(dòng)的關(guān)鍵時(shí)，可能會(huì)發(fā)生什么。”

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