PCR實驗需要注意的問題及原因

PCR實驗，即聚合酶鏈式反應實驗，是一種用于特異性擴增DNA片段的分子生物學技術。在進行PCR實驗時，需要注意多個問題和細節，以下是對這些問題及其原因的詳細歸納：

一、試劑與材料的選擇與準備

試劑的質量：

確保所有試劑（如ddH2O、引物、DNA模板、商業化的預混DNA酶等）均為高質量且未過期。

不同品牌的試劑性能可能有所不同，因此需要根據實驗需求選擇合適的試劑。

引物的設計：

引物長度通常保持在18-27bp之間，上下游引物Tm值**是60-75℃，GC含量應控制在40%-60%之間。

引物自身及引物之間不應存在互補序列，以避免發夾結構的形成。

引物的特異性要高，避免非特異性擴增。

模板DNA的準備：

確保模板DNA的純度，避免含有雜質，如甲醛固定及石蠟包埋的組織中常含甲酸，會影響PCR結果。

模板DNA的濃度要適中，過高或過低都可能影響PCR擴增效果。

二、實驗操作過程中的注意事項

防止污染：

戴一次性手套操作，避免交叉污染。

使用一次性吸頭，并與PCR產物分析室的吸頭分開存放，避免氣溶膠污染。

設立陰陽性對照和空白對照，以驗證PCR反應的可靠性和擴增系統的可信性。

反應體系的配制：

在冰上準備反應體系，以減少非特異性擴增。

先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，以減少操作次數和污染風險。

最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管。

PCR儀的使用：

確保PCR儀的溫度控制準確，與實際溫度相符。

嚴密監測PCR擴增儀的各項性能指標，確保實驗結果的準確性。

三、實驗結果的分析與常見問題

無條帶或條帶過淡：

可能是PCR程序設置錯誤，如溫度或時間不正確。

也可能是酶失活或未加入酶。

模板DNA量過少或體系中存在DNA抑制劑也可能導致此問題。

條帶不清晰或存在雜帶：

可能是引物特異性不高，同時擴增了模板的其他部分。

也可能是酶的質量不好或引物自聯系數過高出現了引物二聚體。

體系中存在污染也可能導致此問題。

擴增效率低：

可能是反應試劑中部分成分比例不佳或熒光染料降解。

反應條件不夠優化，如退火/延伸溫度不合適或時間不足。

模板中存在抑制物也可能影響擴增效率。

CT值異常：

CT值出現過晚（大于38）可能是反應成分的降解或加樣量不足。

無CT值可能是模板量不足或模板降解。

四、實驗室操作環境的維護

工作區的隔離與標識：

各工作區要有一定的隔離，并按照試劑貯存和準備區、標本制備區、PCR擴增區、產物分析區的順序進行單向操作。

實驗用品的專用與清潔：

各個區域實驗設備和物品應有明確的標記，不能混用。

實驗場所要保持通風良好，并嚴格監測溫濕度。

污染預防：

始終保持“無核酸觀念”，特別注意避免來自樣本、試劑和實驗室各種氣溶膠的污染。

綜上所述，PCR實驗需要注意的問題及原因涉及試劑與材料的選擇與準備、實驗操作過程中的注意事項、實驗結果的分析與常見問題以及實驗室操作環境的維護等多個方面。只有嚴格按照操作規程進行，并注意上述問題和細節，才能獲得準確可靠的實驗結果。