‘帶貨’能力更強(qiáng)的遞送載體eVLP定向進(jìn)化——讓基因編輯/蛋白質(zhì)遞送更安全有效

最近發(fā)表在《Nature Biotechnology》雜志上的一項(xiàng)報(bào)告探究了一種新的、能夠“定向進(jìn)化”出具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力和生產(chǎn)能力的工程病毒樣顆粒（eVLP）的系統(tǒng)。突破性定向進(jìn)化系統(tǒng)促進(jìn)病毒樣顆粒進(jìn)行更安全、更有效的基因編輯，為下一代治療創(chuàng)新提供了強(qiáng)大的工具。

在體外和體內(nèi)有效和安全地將大分子輸送到特定細(xì)胞中的能力，對(duì)于各種新興的治療方式至關(guān)重要。目前主流的遞送載體包括腺相關(guān)病毒載體（AAV）、慢病毒載體及非病毒載體如脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等，但它們各自存在一些局限性。因此，仍需要開發(fā)新的遞送方法來克服這些限制，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)高效更大載量的遞送。

病毒樣顆粒（VLPs，virus-like particles）是一種由病毒衣殼蛋白自發(fā)組裝而成的納米顆粒，兼具病毒粒子組織趨向性和高效轉(zhuǎn)導(dǎo)能力又不含病毒遺傳物質(zhì)——可避免病毒載體潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，且具有非病毒載體的瞬時(shí)遞送特性——“業(yè)務(wù)范圍”包括遞送mRNA、蛋白質(zhì)或核糖核蛋白（RNP）等生物大分子“貨物”，能減少脫靶編輯和實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)“貨物”表達(dá)。以該研究作者此前開發(fā)的eVLP——工程化病毒樣顆粒為例，貨物蛋白與eVLP中的逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag蛋白融合，在病毒顆粒包裝形成時(shí)將貨物定位到病毒顆粒中。貨物-Gag之間的連接序列中包含一個(gè)序列，可由逆轉(zhuǎn)錄酶裂解，隨后將病毒樣顆粒內(nèi)的貨物釋放到轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中，在體外和體內(nèi)實(shí)現(xiàn)更有效的傳遞。

要尋找能更有效包裝“貨物”、或者更高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的病毒類遞送載體，通常的做法是利用病毒基因組突變文庫定向篩選的實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化。但是，所有定向進(jìn)化系統(tǒng)都需要一種方法，在進(jìn)行特定屬性的選擇之后能確定所需的突變體。由于eVLPS沒有包裝任何病毒性遺傳物質(zhì)，應(yīng)用定向進(jìn)化來改善eVLPS需要開發(fā)一種替代策略來編碼標(biāo)記eVLP突變的身份。這篇報(bào)告中，研究人員設(shè)想在eVLP包裝的貨物中插入一段帶條碼（barcoded）的sgRNA，在無DNA的 eVLP包裝貨物中作為每個(gè)eVLP突變體的**標(biāo)識(shí)，這樣經(jīng)過所需屬性的篩選后，排名靠前的幸存者就可以通過**標(biāo)識(shí)而被識(shí)別出來。這種針對(duì)eVLP的定向?qū)嶒?yàn)室進(jìn)化條碼策略原則上可用于不同的eVLP組分，比如衣殼、包膜和其他結(jié)構(gòu)蛋白，只要把條碼sgRNA和進(jìn)化目標(biāo)放在一起，能夠發(fā)現(xiàn)具有改進(jìn)特性的eVLP突變體。

作者首先驗(yàn)證帶條碼的sgRNA與功能性eVLP生產(chǎn)兼容。他們將15個(gè)堿基的條碼序列插入sgRNA骨架的四核苷酸環(huán)（ tetraloop）——此位置和插入長度不會(huì)影響sgRNA功能。他們用此前開發(fā)的第四代（v4）堿基編輯器(BE)- eVLP——包裝了一個(gè)活性腺嘌呤BE (ABE) RNP貨物，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過將4個(gè)質(zhì)?！謩e編碼Gag-ABE融合、Moloney小鼠白血病病毒（MMLV）Gag-Pro-Pol多蛋白（其中含有所需的病毒蛋白酶和其他結(jié)構(gòu)性成分）、水皰性口炎病毒G（(VsV-G)）包膜蛋白、和指導(dǎo)靶標(biāo)堿基編輯的sgRNA——共轉(zhuǎn)染到產(chǎn)生細(xì)胞中制備標(biāo)準(zhǔn)v4 BE-eVLPs。

作者制備了含有標(biāo)準(zhǔn)和四種分別帶不同條碼sgRNA的v4 eVLP，并通過測量它們轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293T細(xì)胞后的堿基編輯效率（BCL11A位點(diǎn)）進(jìn)行了比較。他們發(fā)現(xiàn)具有不同條碼sgRNA的eVLP具有相當(dāng)?shù)男ЯΓc標(biāo)準(zhǔn)eVLP相當(dāng)。這說明他們“加塞”條碼的sgRNA能夠與功能性eVLP生產(chǎn)兼容，基本不影響。此外，缺乏Gag-ABE融合的eVLP比標(biāo)準(zhǔn)v4 eVLP封裝的sgRNA少216倍。

然后作者驗(yàn)證了帶條碼的eVLPS可以用來區(qū)分具有不同功能性質(zhì)的EVLP突變體。為此進(jìn)行了兩個(gè)模擬篩選：一個(gè)是包裝貨物的eVLP生產(chǎn)選擇，另一個(gè)是HK293T細(xì)胞的EVLP轉(zhuǎn)導(dǎo)選擇。結(jié)果表明，帶條碼的sgRNA可以用于標(biāo)記不同的eVLP突變體，并且經(jīng)過選擇后富集的條碼可以識(shí)別出適應(yīng)性增強(qiáng)的突變體，驗(yàn)證了條碼化eVLP進(jìn)化系統(tǒng)的關(guān)鍵，并確立了一個(gè)用于使用條碼sgRNA來識(shí)別具有所需屬性的eVLP突變體的框架。

V5

接下來，作者應(yīng)用條碼化eVLP進(jìn)化系統(tǒng)來選擇具有改進(jìn)性能的eVLP衣殼。V4 eVLPS中使用的衣殼蛋白與野生型MMLV中使用的衣殼蛋白相同——這個(gè)在自然界中已經(jīng)進(jìn)化成為包裝病毒基因組的**選擇。而對(duì)于包裝大型的非本土蛋白貨物，這可能不是**的。作者假設(shè)改造eVLP衣殼蛋白內(nèi)部或許能夠優(yōu)化ABE RNP貨物包裝，而不是病毒基因組包裝，可以提高eVLP的性能，包括每個(gè)顆粒的效力、每個(gè)顆粒包裝的貨物分子數(shù)、總體顆粒產(chǎn)量或滴度和顆粒穩(wěn)定性。

為此，作者生成了一個(gè)帶條碼的eVLP衣殼文庫——包含了Gag-ABE貨物中MMLV Gag蛋白衣殼和核衣殼結(jié)構(gòu)域的3762個(gè)單殘基突變體，并實(shí)施了一個(gè)庫建設(shè)策略以保存條碼和突變體之間的聯(lián)系，以便對(duì)選擇結(jié)果進(jìn)行解碼。用這個(gè)條碼庫構(gòu)建條碼eVLP生產(chǎn)細(xì)胞庫，生產(chǎn)eVLP，并純化得到的衣殼突變體文庫。

條碼化eVLP衣殼文庫分別進(jìn)行兩次篩選，以提高生產(chǎn)細(xì)胞的產(chǎn)量和對(duì)HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

隨后，分離出eVLP包裝的sgRNA，并對(duì)經(jīng)過產(chǎn)量篩選出的條碼進(jìn)行測序。對(duì)每個(gè)條碼序列的eVLP產(chǎn)物的富集程度進(jìn)行了評(píng)估，與標(biāo)準(zhǔn)eVLP衣殼相比，鑒定出eVLP富集程度更高的條碼。文庫中約8%的衣殼突變體比標(biāo)準(zhǔn)eVLP衣殼具有更高的產(chǎn)量富集。由于大多數(shù)衣殼突變很可能會(huì)破壞小心的組織過程，因此篩選出比標(biāo)準(zhǔn)衣殼更高效的突變是少見的。

HEK293T細(xì)胞用純化的條碼化eVLP衣殼文庫孵育。6小時(shí)后，分離轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞的sgRNA，計(jì)算每個(gè)條碼序列的eVLP轉(zhuǎn)導(dǎo)富集。

只有0.7%的衣殼突變體的平均轉(zhuǎn)導(dǎo)富集度高于標(biāo)準(zhǔn)v4 eVLP衣殼。衣殼突變體更有可能提高eVLP生產(chǎn)或RNP貨物包裝，但很少提高類病毒顆粒穩(wěn)定性、進(jìn)入細(xì)胞或其他影響轉(zhuǎn)導(dǎo)的特性。

根據(jù)生產(chǎn)效率或轉(zhuǎn)導(dǎo)選擇富集，選擇了幾個(gè)突變體進(jìn)行進(jìn)一步分析。優(yōu)先考慮那些能提高一種特性而不損害另一種特性的突變體。

在Gag-ABE構(gòu)建體中引入衣殼突變并沒有增加效力。研究人員評(píng)估了具有Q226P突變的Gag-ABE構(gòu)建體的衣殼突變的效力，該突變?cè)贕ag-Pro-Pol構(gòu)建體的生產(chǎn)選擇中最為豐富（GagQ226P-Pro-Pol）。與V4 eVLP相比，不同的衣殼突變體將BE的遞送能力提高了三倍。C507V、C507F、A505W、D502Q、R501I 5個(gè)突變的效價(jià)最高；然而，一個(gè)突變組合GagC507V-ABE與GagQ226P-Pro-Pol的效力提高了3.7倍，被指定為第五代（v5）BE - eVLP。

比較了V4和V5 BE- eVLP的效價(jià)，結(jié)果表明V5的堿基編輯效率顯著高于V4。

本研究的研究人員開發(fā)了具有所需特性的eVLP定向進(jìn)化系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)突變/選擇具有增強(qiáng)特性的eVLP衣殼突變體。此外，與v4版 eVLP相比，v5 eVLP具有增強(qiáng)的貨物包裝和釋放，更大的粒徑和更高的遞送效力。總的來說，這種帶條形碼的eVLP進(jìn)化方法可以支持未來運(yùn)載工具的開發(fā)，克服當(dāng)前基因編輯系統(tǒng)的局限性。

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