支原體檢測常見問題答疑（二）——MB支原體檢測試劑盒

   上篇文章是支原體檢測常見問題（一），小編解答了部分的支原體污染檢測問題，本期締一生物小編繼續(xù)結(jié)合德國MB公司支原體檢測試劑盒來跟大家分享支原體檢測問題答疑。

問：被動參比染料是選“none”吧？

答：對，沒有ROX，選none

問：大家好，想咨詢一下，咱們支原體DNA提取時所取的樣本量是依據(jù)什么定的呢，比如，我們有CAR-T細胞，病毒液等，如果CAR-T細胞按細胞數(shù)來的話取多少細胞數(shù)比較好，或者如果病毒液按體積的話多少體積更佳呢？

答：支原體 DNA 提取試劑盒可從最多含有 1X 10⁶細胞/ml 的細胞上清中直接分離 DNA，病毒沒有要求。總體積最多 200μl。提取的樣本就是細胞上清，ATMPs（高級醫(yī)用藥品），細胞培養(yǎng)基等。病毒液應(yīng)該也是最初來自細胞上清吧。樣本量是根據(jù)支原體污染量得出的經(jīng)驗值，跟核酸純化柱上的DNA膜吸附能力有關(guān)。

問：病毒液就是類似細胞上清的。如果體積大于200ul的話我們可以濃縮，但是這個體積有沒有一個上限呢？

答：體積有上限，是200 to 1000 μl, 可以參看經(jīng)典法試劑盒的那個說明書里對樣本處理那一塊。這個樣本量同時還考慮了靈敏度，使檢測達到**的靈敏度。如果細胞數(shù)高于1X 10⁶細胞/ml ，那必須要先調(diào)細胞數(shù)了。或者減少樣本體積，總細胞數(shù)不超，也行。

問：您好，我這邊要提取10cfu對照品的基因組，10cfu對照品的說明書寫著用1ml基質(zhì)重懸，基因提取試劑盒說一次上樣200μl進行提取，想問您一下，用200μl基質(zhì)重懸10cfu可以嗎，想一次提完。

答：還是建議用1ml的基質(zhì)重懸，因為靈敏度是以10CFU/ml為單位的。如果用200ul，濃度就高了。廠家建議10CFU標準品復(fù)溶了以后，要立即用完，不要再保存，擔心可能降解。

問：那1ml溶解的標準品，按提取試劑盒的要求，就得用多個管子一次提完對吧？

答：是的。

問：這個抽提試劑盒的收率有多少，是磁珠還是吸附柱？吸附柱的收率**能有，因為以前我們用其他品牌的抽提試劑盒，收率只有百分之六，這樣的話，就存在假陰性結(jié)果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取試劑盒的COA里，用的是很少量的支原體10CFU/ml，提取DNA后都可以檢測到。廠家來信說，產(chǎn)率依賴于DNA的類型（如GC含量，是基因組還是質(zhì)粒）、操作者的技巧以及樣本基質(zhì)的情況。因為這些情況，操作者很難達到生產(chǎn)商所給的比率，從而形成各種討論，因此產(chǎn)率沒寫到說明書里。

問：要檢測支原體的培養(yǎng)基中有酚紅，是否還需要抽提？

答：只要是在25ulPCR體系中加入的樣本量≤2ul，酚紅就不會對qPCR構(gòu)成問題。更高濃度的酚紅會引起基線偏移，造成靈敏度降低。如果僅僅是篩查，則不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的產(chǎn)品放行檢查，則需要抽提了。細胞基質(zhì)的驗證總是要做的。

問：做qPCR，一個陰性對照Ct約為40，也有擴增曲線。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于產(chǎn)生非特異性信號（如primer artefacts）以及極微小的污染所致。 但是，該結(jié)果是不具有可重復(fù)性的，因此結(jié)果仍然是陰性。

問：一步法的盒子的靈敏度是否總低于經(jīng)典法試劑盒？有沒有可能一步法的盒子也能檢測10CFU？

答：廠家回復(fù)如下：意思是一步法的樣本量為2ul用于支原體篩查，經(jīng)典法為10ul，用于產(chǎn)品的放行檢測。檢測10CFU的標準品非常具有挑戰(zhàn)性。一步法因為樣本量不夠，很難達到10CFU/ml。如果客戶想要包含DNA聚合酶的PCR試劑盒，可以選擇VenorGeM Classic G型試劑盒。它和經(jīng)典法（不含酶）的交叉驗證確實做過，顯示同樣的靈敏度。但全套的驗證沒有做過。

問：支原體10cfu標準品是干粉吧？ 配完后是多少體積？

答：是凍干粉，加基質(zhì)液后是1ML體積。

問：基質(zhì)液產(chǎn)品里帶嗎？

答：這個產(chǎn)品里不帶，是客戶自己要檢測哪類樣品，就用樣品里的基質(zhì)液（例如用的哪個培養(yǎng)基）

   由于篇幅有限，以上就是支原體檢測常見問題答疑（二），我們下篇文章繼續(xù)分享。如果您還想了解更多的信息，可咨詢德國MB中國區(qū)總代理北京締一生物科技有限公司官網(wǎng)：www.276mk.com。