支原體檢測常見問題答疑（三）——MB支原體檢測試劑盒

上篇文章是支原體檢測常見問題（一）和（二），小編解答了部分的支原體污染檢測問題，本期締一生物小編繼續結合德國MB公司支原體檢測試劑盒來跟大家分享支原體檢測問題答疑。

問：PCR經典法，跑膠時體現1條陽性帶，是否代表PCR經典法可以檢測多種支原體，無法區分支原體種類。

答：PCR經典法，跑膠時為1條陽性帶，無法區分支原體種類，需要將擴增產物測序鑒定。

問：?支原體標準品一管可以用幾次？

答：1管可以用4次，廠家原文是actually you will get 4x 200 ul out of one vial. The kit consists of 3 vials. Replicates of 8 tests are usually required for a validation. So 2 tubes are needed and 1 is for safety.

問：qEP的陽性對照一個25次的盒子里大概可以做幾次？

答：這個陽性對照是綠蓋管，復溶是加300ul水。如果是科研，每次用2ul。制藥是每次用10ul，這樣分別是做150次和30次。但是大包裝的qEP的陽性對照仍然只是1管或2管。

問：10CFU標準品，驗證實驗中用量，即驗證實驗時需多少有效數據？

答：10CFU標準品，使用時需要用1ml你的樣本基質（如培養基）溶解，然后需要提取支原體DNA，以保證最高靈敏度（推薦MB公司的支原體DNA提取試劑盒）。每個DNA純化柱需要樣本量是200ul，產出是50ul。每個qPCR反應需要加DNA樣本量是10ul。MB廠家推薦1個樣本是8個復孔。一般靈敏度與耐用性（Robust）是在一起驗證的，也就是說，要前后做3輪獨立試驗，每次每個樣本建議是8個復孔，這樣計算下來，2管10CFU標準品是夠用了，這也正是10CFU標準品現在的包裝。說明：為保證結果可靠性，還需要同時做陰性對照。

問：qPCR法，是否需要分別用不同種類DNA定量標準品分別做標曲，來檢測同一個樣本，那引物探針是否是根據不同種類支原體而不同。

答：qPCR法，如要定量，先需確定是測定哪種支原體，再用該支原體DNA標準品做標曲。引物探針都是用的MB公司的同一mix，它可識別多種支原體物種。

問：一管DNA定量標準品稀釋后能用多久，如何保存。

答：一管DNA定量標準品稀釋后在-18℃以下保存。避免反復凍融。保存時間和標簽上的效期一樣。

問：如何設置閾值線？ 據我所知，基線通常是循環3到循環15的值。閾值線是基線標準差的10倍。這正確嗎？

答：設置閾值的一種好方法是將其置于陽性對照擴增曲線的線性區域的中間（如果以對數坐標顯示）。

問：內控對照的曲線和樣品擴增曲線是否共享同一閾值線？

回答：是的。

問：是否每次做支原體DNA抽提時都要設陰性對照？

答：不需要。只有靈敏度標準品抽提時才需要設陰性對照，以避免外源干擾。

   以上內容就是支原體檢測常見問題答疑（三）的全部內容了，其他內容可以查看上一篇文章。如果您還想了解更多的信息，可咨詢德國MB中國區總代理北京締一生物科技有限公司官網：www.276mk.com。