支原體qPCR檢測｜微生物快檢方法驗(yàn)證

支原體是一種無細(xì)胞壁的已知體積非常小的原核微生物，其大小介于細(xì)菌和病毒之間（直徑約0.1-0.8 μm），因此一般細(xì)菌過濾器（0.22 μm）無法有效去除。支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域普遍存在。

支原體嚴(yán)重影響培養(yǎng)中的細(xì)胞的表型特征和正常生長，給藥品質(zhì)量安全控制帶來了極大的風(fēng)險(xiǎn)。因此，細(xì)胞培養(yǎng)過程中的支原體檢測非常必要。與細(xì)菌、真菌污染不同的是，支原體的存在不一定導(dǎo)致培養(yǎng)液渾濁或細(xì)胞的可見改變，因此需要合適的方法進(jìn)行檢測。

FDA、WHO等不同國家和地區(qū)監(jiān)管機(jī)構(gòu)和USP、EP、ChP等法規(guī)均對(duì)支原體檢查提出了要求，主要包括測試細(xì)胞庫（主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫），收獲前的下游細(xì)胞培養(yǎng)物，終產(chǎn)品以及對(duì)照細(xì)胞等是否受到支原體污染。

支原體核酸法的法規(guī)要求

傳統(tǒng)的檢測方法主要有培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法，一般要求同時(shí)進(jìn)行檢測。這2種方法通常需要較長時(shí)間，如培養(yǎng)法至少28天。近年來，細(xì)胞治療藥物快速發(fā)展，且其上市周期快，貨架期短，培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法均無法滿足藥物放行的時(shí)間要求。

核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT），如熒光探針qPCR檢測方法由于其檢測時(shí)間短和特異性好等優(yōu)勢而被用于支原體檢測。作為替代方法，NAT檢測方法需確證能達(dá)到法規(guī)所要求的檢測靈敏度。檢測靈敏度達(dá)到10CFU/mL，可替代培養(yǎng)法；達(dá)到 100CFU/mL，可替代指示細(xì)胞培養(yǎng)法。

合適的支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株是進(jìn)行支原體NAT檢測方法驗(yàn)證的首要條件。基于污染的發(fā)生頻率和進(jìn)化關(guān)系，中國、歐洲、美國、日本4個(gè)國家和地區(qū)的藥典一致提出優(yōu)先使用豬鼻支原體、口腔支原體、肺炎支原體3種支原體作為標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行NAT方法檢測限的驗(yàn)證。

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支原體qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：

①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果

③檢測結(jié)果可定量

④操作簡便

缺點(diǎn)：

①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。