支原體qPCR檢測｜微生物快檢方法驗證

支原體是一種無細胞壁的已知體積非常小的原核微生物，其大小介于細菌和病毒之間（直徑約0.1-0.8 μm），因此一般細菌過濾器（0.22 μm）無法有效去除。支原體污染在細胞培養領域普遍存在。

支原體嚴重影響培養中的細胞的表型特征和正常生長，給藥品質量安全控制帶來了極大的風險。因此，細胞培養過程中的支原體檢測非常必要。與細菌、真菌污染不同的是，支原體的存在不一定導致培養液渾濁或細胞的可見改變，因此需要合適的方法進行檢測。

FDA、WHO等不同國家和地區監管機構和USP、EP、ChP等法規均對支原體檢查提出了要求，主要包括測試細胞庫（主細胞庫、工作細胞庫），收獲前的下游細胞培養物，終產品以及對照細胞等是否受到支原體污染。

支原體核酸法的法規要求

傳統的檢測方法主要有培養法和指示細胞法，一般要求同時進行檢測。這2種方法通常需要較長時間，如培養法至少28天。近年來，細胞治療藥物快速發展，且其上市周期快，貨架期短，培養法和指示細胞法均無法滿足藥物放行的時間要求。

核酸擴增技術（NAT），如熒光探針qPCR檢測方法由于其檢測時間短和特異性好等優勢而被用于支原體檢測。作為替代方法，NAT檢測方法需確證能達到法規所要求的檢測靈敏度。檢測靈敏度達到10CFU/mL，可替代培養法；達到 100CFU/mL，可替代指示細胞培養法。

合適的支原體標準菌株是進行支原體NAT檢測方法驗證的首要條件。基于污染的發生頻率和進化關系，中國、歐洲、美國、日本4個國家和地區的藥典一致提出優先使用豬鼻支原體、口腔支原體、肺炎支原體3種支原體作為標準菌株進行NAT方法檢測限的驗證。

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支原體qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規PCR基礎上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記，使PCR擴增后的產物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應的實時監測，簡稱qPCR。

優點：

①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結果

③檢測結果可定量

④操作簡便

缺點：

①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結果會出現假陽性。（可用培養法做補充驗證）

②不同廠家生產的試劑盒質量差異巨大（由于引物及內在設計不同），需謹慎選擇，盡量在專業人員推薦指導下使用。