支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總（三）

　　大家晚上好!

　　細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體檢測(cè)方法如約而至，第三期來(lái)啦!

　　上回書(shū)和上上回書(shū)說(shuō)道qPCR檢測(cè)法是一種目前比較常用，效果也比較可靠的方法，那除了qPCR，還有沒(méi)有其他方法可以檢測(cè)呢?

　　所以今天就來(lái)講講分離培養(yǎng)法和DNA染色法。

　　有請(qǐng)兩位主角閃亮登場(chǎng)

　　1.分離培養(yǎng)法

　　簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，這種方法的基本原理就是：分離，然后培養(yǎng)，聽(tīng)君一席話如聽(tīng)一席話，展開(kāi)來(lái)講，就是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，接種到適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上瘋狂生長(zhǎng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。操作規(guī)范的情況下，這種方法很少會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測(cè)精確度很高，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。 缺點(diǎn)就是檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。另一方面，盡管可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. Hyorhinis。因此，該方法能鑒定的支原體種類有限，成為它的另一個(gè)缺點(diǎn)。

　　2.DNA染色法

　　該方法的實(shí)驗(yàn)思路是：

　　培養(yǎng)指示細(xì)胞 ?

　　樣品上清液收集 ?

　　上清液接種 ?

　　染色觀察結(jié)果

　　這一波操作看起來(lái)有點(diǎn)復(fù)雜，那展開(kāi)說(shuō)說(shuō)：將供試品接種于指示細(xì)胞(無(wú)污染的Vero 細(xì)胞或經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞，供試品應(yīng)對(duì)該細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響。下面以Vero細(xì)胞為例)中培養(yǎng)后，用特異熒光染料(如Hoechst 33258)染色，支原體中的核酸也可以被著色，因此，如果待檢測(cè)細(xì)胞中含有支原體，那么就會(huì)導(dǎo)致指示細(xì)胞被感染，進(jìn)而在細(xì)胞膜或培養(yǎng)基等處發(fā)現(xiàn)藍(lán)色熒光(支原體附著在細(xì)胞膜上，也有可能游離在細(xì)胞培養(yǎng)基中)。

　　指示細(xì)胞培養(yǎng)：將指示細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，調(diào)整至**狀態(tài)，留出適宜的量備用。

　　樣品上清液收集：無(wú)抗生素培養(yǎng)基中加入待檢測(cè)樣品后，細(xì)胞需至少傳一代，然后取細(xì)胞已長(zhǎng)滿且3 天未換液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液待檢。(為了對(duì)待檢測(cè)樣品中的支原體進(jìn)行富集)

　　上清液接種：在制備好的指示細(xì)胞培養(yǎng)板中加入一定量的待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，36°C培養(yǎng)3-5 天。指示細(xì)胞培養(yǎng)物至少傳代1 次，末次傳代培養(yǎng)可用6孔板培養(yǎng)3-5 天。

　　染色觀察：吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加入固定液，放置5分鐘。吸出固定液后進(jìn)行10min的二次固定，再次吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干燥。加DNA 染料工作液5ml，加蓋，室溫放置30分鐘，漂洗3次，干燥，封片。用熒光顯微鏡觀察。熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面或培養(yǎng)基中，有大小不等、不規(guī)則的藍(lán)色熒光著色顆粒，則說(shuō)明有可能存在支原體污染。

　　對(duì)于DNA染色法方法，優(yōu)缺點(diǎn)也是很明顯的：

　　優(yōu)點(diǎn)：

　　1、適用于一些不易培養(yǎng)的支原體，如豬鼻支原體，分離培養(yǎng)法對(duì)該支原體檢測(cè)并不可靠，但可用DNA染色法準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)。

　　2、操作步驟雖然多，但都相對(duì)簡(jiǎn)單

　　3、靈敏度尚可。

　　缺點(diǎn)：

　　1、時(shí)間較長(zhǎng)，從Vero細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，再到收集上清后再次培養(yǎng)，有時(shí)甚至需要十幾天時(shí)間

　　2、存在假陽(yáng)性和假陰性的可能：如一些死亡細(xì)胞釋放出來(lái)的DNA會(huì)被染成藍(lán)色，出現(xiàn)假陽(yáng)性;或是由于熒光過(guò)若而出現(xiàn)假陰性使結(jié)果出現(xiàn)偏差，因此使用這個(gè)方法需要一定的經(jīng)驗(yàn)。 今天的兩種方法就介紹到這里啦，如果對(duì)支原體檢測(cè)感興趣，也可以點(diǎn)擊文末的閱讀原文，了解更多詳情!