支原體常規(guī)檢測方法匯總（四）

　　大家晚上好!

　　不知不覺細胞培養(yǎng)過程中支原體檢測內(nèi)容已經(jīng)更新到第四期了，回顧一下知識點。

　　被廣泛使用的方法

　　基于Venor?Gem qEP經(jīng)典法試劑盒的qPCR檢測法，目前使用較為廣泛，擁有高特異性、高靈敏度等特點，還可以選配支原體和細菌DNA、支原體絕對定量標準品，來進行特異性驗證、定量檢測。

　　經(jīng)典法pro版

　　基于Venor?Gem qOneStep一步法試劑盒的qPCR檢測法，是經(jīng)典法的升級版本，包含經(jīng)典法所有優(yōu)點。另外，內(nèi)控已配置好，更加省時省力。

　　傳統(tǒng)認為的金標準

　　分離培養(yǎng)法被認為是支原體檢測的金標準，準確率比較高，但培養(yǎng)周期長，而且對于一些特定支原體無法培養(yǎng)。

　　操作步驟多但簡單

　　DNA染色法檢測支原體雖然操作步驟較多，包含指示細胞培養(yǎng)，上清液共培養(yǎng)、染色等多個過程，但并不復雜，對技術要求相對沒有那么高。

　　今天我們就來介紹最后兩種常見檢測法 ELISA法和PCR法，廢話不多說，我們直接上干貨。

　　ELISA法

　　首先我們先來簡單了解一下ELISA：

　　酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA或ELASA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。根據(jù)免疫吸附劑、酶聯(lián)物、結(jié)合物這些試劑的來源、樣本情況，檢測具體條件，可以分為夾心法、競爭法、間接法等不同類型。

　　支原體檢測過程中用到的ELISA，一般采用的是夾心法，針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體，來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。

　　先用純化過的支原體抗體包被微孔板，制成固相抗體。 ?

　　往微孔板中依次加入支原體(Mycoplasmal)，再與 HRP(一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物)標記的支原體抗體結(jié)合，形成抗體 -抗原-酶標抗體復合物。 ?

　　經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。

　　最后用酶標儀分析結(jié)果：

　　顏色的深淺和樣品中的支原體( Mycoplasmal)呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度( OD值)，通過標準曲線計算樣品中支原體濃度。整個過程時間比較短，一般三四個小時就能出結(jié)果。

　　整個過程除取樣外，還包括標準品稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、結(jié)果分析，步驟比較多，且很多步驟都需要有一定經(jīng)驗的人操作才能保證準確性，因此對技術要求比較高。

　　另外，由于依賴抗體的特性，該方法能夠檢測的支原體種類比較有限，對于沒有抗體的支原體，ELISA就無能為力了。

　　PCR法

　　常規(guī)PCR法：根據(jù)支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設計引物，對待檢樣本DNA進行擴增，通過對擴增產(chǎn)物的大小分析作出判斷。以Venor?Gem OneStep支原體常規(guī)PCR檢測試劑盒為例，簡單介紹一下實驗流程。

　　樣本處理

　　與qPCR類似取適量待檢測樣品上清95℃孵育10min以對樣品進行穩(wěn)定化處理 ?

　　試劑制備

　　離心?按比例混合?靜置?混勻 ?

　　PCR體系建立

　　設置好陰性對照、陽性對照、重復孔扣緊蓋子混勻 ?

　　啟動PCR反應

　　根據(jù)使用說明設置好程序 ?

　　電泳結(jié)果分析

　　191bp為內(nèi)控對照條帶，表明PCR反應正常。

　　當樣本存在支原體污染時，由于內(nèi)控對照與支原體DNA存在競爭，內(nèi)控對照條帶變?nèi)?例如支原體DNA>1000拷貝)。陽性對照中支原體DNA>10000拷貝，內(nèi)控對照條帶會完全消失。可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結(jié)果。如果待測樣本對PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對照條帶變?nèi)?和陰性對照相比)，此時應先進行DNA抽提(推薦使用：Venor? Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒)，然后再檢測。

　　常規(guī)PCR的優(yōu)點就是檢測時間短：2-3小時即可出結(jié)果、靈敏度高、特異性強、操作簡單。 缺點也很明顯，用PCR檢測已經(jīng)進行過支原體滅活的樣品時，由于支原體DNA依然存在，所以此時PCR結(jié)果仍為陽性，說明該樣品曾經(jīng)感染過支原體。另外不同廠家的試劑盒差異比較大，需要謹慎選擇。

　　ELISA法

　　至此，幾種常規(guī)的檢測方法都已經(jīng)介紹給大家啦，給大家做了個小總結(jié)，供參考。有些單一的檢測方法并不嚴謹，需要結(jié)合實驗情況，聯(lián)合使用多種方法進行檢驗，確保結(jié)果的可信度。 培養(yǎng)法是金標準，但是周期長，有些支原體還檢測不到;染色法普適性強，操作簡單，但是對于支原體數(shù)量有要求，也容易有假陽性假陰性;ELISA法耗時短，但是對操作人員要求比較高，需要獲得相應抗體才可以進行試驗;常規(guī)PCR法，基本包含了上面所有的優(yōu)點，但是不能分辨支原體的死活，用到的試劑盒也是良莠不齊; qPCR法，涵蓋上述所有優(yōu)點，但是對實驗人員有一定的經(jīng)驗要求，因此該方法目前也是十分常用的檢測手段。