德國(guó)MB助力生物科研，單細(xì)胞CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)GWAS位點(diǎn)

全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWASs)已經(jīng)確定了數(shù)千種與多種疾病和性狀相關(guān)的人類遺傳變異，其中大多數(shù)變異映射到具有未知靶基因和功能的非編碼位點(diǎn)。目前，了解哪些GWAS基因座含有因果變異以及將這些非編碼調(diào)節(jié)因子映射到靶基因的方法都存在低通量的問(wèn)題。隨著來(lái)自不同祖先個(gè)體的新的多祖先GWAS，迫切需要大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)分析來(lái)將GWAS變異與分子機(jī)制聯(lián)系起來(lái)。

近日，研究人員結(jié)合生物庫(kù)規(guī)模的GWAS、大規(guī)模并行CRISPR篩選和單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)血液性狀位點(diǎn)非編碼變異的靶基因，并使用單細(xì)胞測(cè)序(STING-seq)系統(tǒng)靶向和抑制非編碼GWAS位點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)表在《Science》上，文章標(biāo)題為：“Discovery of target genes and pathways at GWAS loci by pooled single-cell CRISPR screens”。

基本原理

血液特征是高度多基因的，GWASs已經(jīng)鑒定出數(shù)千個(gè)與候選順式調(diào)控元件(cre)相關(guān)的非編碼位點(diǎn)。通過(guò)結(jié)合cre沉默CRISPR擾動(dòng)和單細(xì)胞讀數(shù)，我們?cè)谝淮螜z測(cè)中靶向了數(shù)百個(gè)GWAS位點(diǎn)，揭示了順式和反式的靶基因。對(duì)于選擇調(diào)控靶基因的cre，我們進(jìn)行了直接變異插入。雖然沉默CRE可以識(shí)別靶基因，但直接插入變體可以識(shí)別對(duì)GWAS變體基因表達(dá)的影響程度和方向。在靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子或microRNA的特定情況下，我們還研究了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在CRE擾動(dòng)下的改變，以及這些網(wǎng)絡(luò)在不同血細(xì)胞類型之間的差異。

結(jié)果

我們抑制了來(lái)自人類紅系祖先精細(xì)定位的血液性狀GWAS變異(來(lái)自約75萬(wàn)不同祖先的個(gè)體)的候選cre。總共，我們將543個(gè)變異(254個(gè)位點(diǎn))定位到候選cre，生成多模態(tài)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，包括轉(zhuǎn)錄組、直接CRISPR gRNA捕獲和細(xì)胞表面蛋白。

我們確定了134個(gè)CREs的cis靶基因(在500 kb內(nèi))。在大多數(shù)情況下，我們發(fā)現(xiàn)靶基因是最近的基因，并且特定的增強(qiáng)子相關(guān)生化標(biāo)記(H3K27ac和可接近的染色質(zhì))對(duì)CRE功能至關(guān)重要。利用同一位點(diǎn)的多重?cái)_動(dòng)，我們能夠區(qū)分連鎖不平衡中的因果變異和非因果變異。對(duì)于一個(gè)已驗(yàn)證的cre子集，我們還使用堿基編輯STING-seq (besting -seq)插入了特定的GWAS變體，并量化了GWAS變體對(duì)基因表達(dá)的影響大小和方向。考慮到我們的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們檢查了順式靶點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子或microRNA的情況下順式和反式的劑量效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)反式靶基因也富集于GWAS位點(diǎn)，并在反式基因網(wǎng)絡(luò)中鑒定出具有不同生物學(xué)功能的基因簇，并在原代人血細(xì)胞中表達(dá)模式。

結(jié)論

在這項(xiàng)工作中，我們大規(guī)模研究了非編碼GWAS變異，鑒定了單細(xì)胞中的靶基因。這些方法可以幫助解決變異到功能的挑戰(zhàn)，這是翻譯GWAS發(fā)現(xiàn)的障礙(例如，具有遺傳基礎(chǔ)的疾病的藥物靶點(diǎn))，并極大地?cái)U(kuò)展了我們理解GWAS基因座背后機(jī)制的能力。

細(xì)胞學(xué)研究也是基因研究的基礎(chǔ)，大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)需要對(duì)環(huán)境污染進(jìn)行控制。德國(guó)MB公司生產(chǎn)的Mycoplasma-off即用型支原體祛除噴霧劑，高效清除包括支原體在內(nèi)的各類微生物污染。