水中微生物DNA提取試劑盒
AquaScreen? Fast Extract
品名 | 貨號 | 規格 |
水中微生物DNA抽提Kit 英文名：AquaScreen? Fast Extract | 32-1010 32-1050 | 10次/盒 50次/盒 |
一、產品用途：
水中微生物DNA提取試劑盒（英文名：AquaScreen? Fast Extract）用于從水樣中提取微生物DNA。該試劑盒遵循ISO/TS 12869:2012的設計要求。提取的DNA可用于下游的PCR或qPCR檢測。
二、工作原理：
該試劑盒采用0.4μm濾膜截獲微生物，然后微生物被加入到濾膜上的離子活性劑和促溶劑裂解。隨后進行DNA抽提。
DNA抽提由四步組成：
1. 菌體裂解
2. DNA與離心柱的特異結合
3. 祛除殘留污染物和抑制劑
4. DNA的洗脫
整個過程大約30分鐘。
三、產品組成：
試劑盒組分 | 試劑盒（10次/盒） | 試劑盒（50次/盒） |
| 組分數量 | 組分數量 |
Membrane Filter（濾膜） | 10張 | 50張 |
Incubation Dishes（平皿） | 10塊 | 50塊 |
Incubation Tubes（孵育管） | 10管 | 50管 |
Spin Columns（離心柱） | 10管 | 50管 |
Collection Tubes（收集管） | 20管 | 100管 |
Sample Storage Tubes（樣本保存管） | 10管 | 50管 |
Lysis Buffer（裂解液） | 25ml×1瓶 | 110ml ×1瓶 |
Binding Buffer（結合液） | 10ml×1瓶 | 25ml×1瓶 |
Wash Buffer 1（洗液1） | 3ml×1管（**次用前加3ml無水乙醇） | 15ml×1瓶（**次用前加15ml無水乙醇） |
Wash Buffer 2（洗液2） | 4ml ×1管（**次用前加16ml無水乙醇） | 12ml×1瓶（**次用前加48ml無水乙醇） |
Elution Buffer（洗脫液） | 2ml×1管 | 2ml×2管 |
注： 批次質控證書（COA）可從MB廠家網站（http://www.276mk.com）下載
或向MB中國區總代理締一生物（http://www.276mk.com）索取。
四、需用戶自己準備的試劑耗材和儀器：
1. 水過濾設備（濾器、真空泵等）（詳情參見附錄）
2. 無水乙醇
3. 反應管（1.5ml或2ml）
4. 離心機
5. 恒溫儀
6. 移液器及帶濾芯吸頭（100l和1000l）
7. 恒溫箱
五、樣本制備須知：
1. 飲用水、浴池水、泳池水及廢水可作為樣本。樣本性狀會影響結果的可靠性，并需要與ISO的水樣采集指南一致（ISO Norm 5667-1至5667-10）。
2. 該試劑盒還適合其他類型的水樣本，如海水樣本。但海水樣本可能有重度的顆粒污染，會降低流速，導致淤積。可預先用常規濾紙過濾。該方法對于處理自來水，以檢測自來水中的軍團菌，效果很好。
3. 水樣應在2-8°C保存，在采集的2天內檢測。不推薦使用防腐劑，因為會使菌體裂解，而濾膜只能截留完整的菌體。
4. 凡是水樣中有懸浮顆粒或固定揮發性成分，則需先用濾紙過濾。
5. 樣本不能離心。
6. 該試劑盒所需樣本體積建議為1000ml。樣本體積最少應為100ml。
7. 該試劑盒不會截獲水中游離的DNA。
8. 該試劑盒不能區分“活的可培養微生物”與“活的不可培養微生物”。
六、操作注意事項：
該試劑盒只用于科研，并且應僅由經過培訓的實驗室人員使用。
所有樣本應視為有潛在危害性，應小心處理。
應始終穿上合適的防護服，戴一次性手套和護目鏡。
請勿向廢棄液體中加漂白劑或酸性溶液。如有液體濺出，請用合適的去污劑和清水處理。
廢棄物可根據當地法規進行處理。
Binding Buffer（結合液）含異丙醇和聚乙二醇辛基苯酚醚，易燃、有害、有腐蝕性。
Wash Buffer 1（洗液1）含硫氰酸胍，有害、有腐蝕性。
七、樣本制備步驟：
（一）操作步驟概覽
（二）操作步驟詳解
步驟1. 樣本過濾
1.1 從試劑盒中小心取出濾膜。用水樣潤濕濾膜。
1.2 將濾膜放置在濾器中，并過濾必要體積的水樣。
步驟2. 菌體裂解
* 提前準備：預先將恒溫儀設置到70℃，將恒溫箱設置到37℃。
2.1將樣本過濾后的濾膜翻轉放置到試劑盒提供的Incubation Dish（平皿）中。
2.2 吸取2ml lysis buffer（裂解液），并加到濾膜上。
2.3 將濾膜浸泡在裂解液中，小心搖勻平皿并在37°C孵育30分鐘。
2.4 用平皿中的裂解液沖洗濾膜，并搖晃平皿10秒鐘。
2.5 將平皿中的400 μl裂解液轉移至Incubation Tube（孵育管），70 °C孵育10分鐘。
2.5a可選項：剩余裂解液可再取400μl用于DNA抽提，以獲得更多的DNA樣本。
2.6 樣本短暫離心，并加入400 μl Binding Buffer（結合液），立即渦旋充分混勻，以防止DNA沉淀。請勿離心樣本，并立即進行下一步。
步驟3. DNA提取
* 提前準備：（1）Wash Buffer 1（洗液1）和Wash Buffer 2（洗液2）**次使用前，用無水乙醇復溶（請參見瓶上標簽）
（2）將恒溫儀設置到70℃，并將Elution Buffer（洗脫液）放在上面預熱。
3.1 將步驟2.6中的混合液（~800 μl）轉移到Collection Tube（收集管）內的Spin Column（離心柱）中，小心液體不要沾到離心柱的邊緣。
3.2 離心柱離心≥10000 × g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。
3.2a 可選擇：在步驟2.5a中，多取的一份樣本重復以上操作，不用換離心柱。
3.3 離心柱中加入500μl洗液1。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。
3.4 離心柱中加入500μl洗液2。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。將離心柱插到一個新的收集管中。
3.5**速度離心3分鐘，以去除殘留的洗液2。
3.6棄掉收集管。將離心柱插入到試劑盒提供的Sample Storage Tube（樣本保存管）中。
3.7吸取60μl已70℃預熱的洗脫液，直接加到離心柱的硅膠膜上。硅膠膜表面應全部覆蓋洗脫液。
3.8室溫靜置2分鐘，然后離心8000×g，2分鐘，以洗脫DNA。
3.9樣本保存管中的洗脫液即包含DNA，可直接用于PCR，或儲存在2~8℃，可存放1周。長期儲存是在≤-18℃。
八、樣本中的細菌數量計算
樣本中的細菌定量需使用PCR定量標準品和qPCR檢測試劑盒（推薦使用德國MB的PCR定量標準品和AquaScreen?qPCR檢測試劑盒，詳見“九、水中細菌精準測定，還需要的相關試劑”）
計算公式：基因組拷貝數/反應 × 比例因子× 校正因子× 
= 微生物數量/升
注：
1. 樣本中的基因組拷貝數：可通過標準曲線定量
2. 比例因子：取1份400l裂解液，比例因子=5
取2份400l裂解液，比例因子=2.5
取3份400l裂解液，比例因子=1.67
3. 校正因子：60l洗脫液中取10l用于qPCR反應，校正因子=6
九、水中細菌精準測定，還需要的相關試劑：
品牌 | 品名 | 貨號 | 規格 |
德國MB | 水中軍團菌qPCR檢測試劑盒 英文名：AquaScreen? Legionella species | 33-2025 | 25次/盒 |
33-2100 | 100次/盒 |
33-3250 | 250次/盒 |
德國MB | 水中嗜肺軍團菌qPCR檢測試劑盒 英文名：AquaScreen? Legionella pneumophila | 34-2025 | 25次/盒 |
34-2100 | 100次/盒 |
34-2250 | 250次/盒 |
德國MB | 水中銅綠假單胞菌qPCR檢測試劑盒 英文名：AquaScreen? Pseudomonas aeruginosa | 34-6025 | 25次/盒 |
34-6100 | 100次/盒 |
34-6250 | 250次/盒 |
德國MB | 水中大腸埃希菌qPCR檢測試劑盒 英文名：AquaScreen? Escherichia coli | 34-7025 | 25次/盒 |
34-7100 | 100次/盒 |
34-7250 | 250次/盒 |
德國MB | 嗜肺軍團菌基因組DNA定量標準品 英文名：Legionella pneumophila PCR Quantification Standards | 52-0101 | 1×108 基因組拷貝/管+緩沖液2ml/管×3管/盒 |
德國MB | 銅綠假單胞菌基因組DNA定量標準品 英文名：Pseudomonas aeruginosa PCR Quantification Standards | 52-0071 |
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